四氢嘧啶生物合成与应用研究进展

孙晓康,张艳艳,张晓元,刘飞

四氢嘧啶生物合成与应用研究进展

孙晓康,张艳艳,张晓元,刘飞1*

山东省药学科学院, 山东 济南 250101

四氢嘧啶是一种保护微生物免受高盐、高渗透压和紫外线辐射等恶劣环境的环状氨基酸衍生物。作为微生物重要的次级代谢产物，四氢嘧啶在生物保护、化妆品、临床医学、环境修复和新能源应用等领域具有广阔的应用前景。本文综述了四氢嘧啶生物合成途径与降解途径、生物合成方法、生物学功能及应用、分离纯化工艺，并对四氢嘧啶开发和工业化应用进行展望。

四氢嘧啶; 生物合成; 研究进展

四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸)是由好氧、化学异养和嗜盐细菌在高渗透条件下合成与积累的一种相容性溶质，分子量142.16 Da，分子式C6H10N2O2（如图1）。四氢嘧啶的分子结构携带多个羧基和环状氨基，分子表面电荷分布密集，形成强烈的静电势，能使细胞内的游离水结构化，具有很强的水分子络合能力。作为嗜盐微生物最常见的相容性溶质，四氢嘧啶平衡细胞内外渗透压、抵御高渗透压的冲击，在高温高压、冷冻干燥和辐射等逆境因素下，对细胞、蛋白质、酶和核酸的结构与功能起到保护作用。四氢嘧啶的保护作用可通过“优先排斥机制”解释[1]，即四氢嘧啶不直接与水溶液中的大分子相互作用，而是被优先排除在蛋白质表面周围的水化壳外，增加大分子的水化作用，从而防止其变性。因此，四氢嘧啶在生物保护、化妆品、临床医学、环境修复和新能源应用等领域具有广阔的应用前景。

图1 四氢嘧啶分子结构

由于日益严格的环保要求，促使国内外研究者通过绿色安全的生物技术生产四氢嘧啶成为重要的发展趋势。本文综述了四氢嘧啶的生物合成及应用研究，为天然活性成分四氢嘧啶的开发和应用提供参考。

1 四氢嘧啶生物合成途径与降解途径

四氢嘧啶的生物合成途径属于天冬氨酸的支路代谢途径[2]（如图2），L-天冬氨酸在天冬氨酸激酶(Ask)和L-天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Asd)的共同催化下生成L-天冬氨酸-β-半醛(ASA)。以ASA为底物，经过三步酶促反应合成四氢嘧啶。首先，通过2,4-二氨基丁酸氨基转移酶(diaminobutyric acid aminoransferase, EctB)催化生成L-2,4-二氨基丁酸(L-2,4-diaminobutyrate, DABA)；其次，在2,4-二氨基丁酸乙酰基转移酶(diaminobutyric acid acetyltransferase, EctA)的催化条件下，将DABA乙酰化生成N-乙酰-L-2,4-二氨基丁酸(N-acetyl-L-2,4-diaminobutyrate, ADABA)；最后，四氢嘧啶合成酶(ectoine synthase, EctC)催化ADABA发生环化缩合反应形成四氢嘧啶。

Schwibbert K等[3]在对DSM 2581T基因组分析的基础上，首次描述四氢嘧啶的降解途径。四氢嘧啶在四氢嘧啶水解酶(DoeA)、N-乙酰-L-2,4-二氨基丁酸脱乙酰酶(DoeB)、L-2,4-二氨基丁酸转氨酶(DoeD)和天冬氨酸半醛脱氢酶(DoeC)的共同催化反应中转化为L-天冬氨酸。

图2 四氢嘧啶生物合成途径和降解途径

2 四氢嘧啶生物合成方法

目前，四氢嘧啶传统的工业化生产主要采用“细菌挤奶”工艺进行制备。嗜盐菌在高渗透压诱导条件下迅速合成四氢嘧啶，然后在低渗透压冲击条件下释放细胞内的四氢嘧啶，四氢嘧啶在该过程反复循环的合成与释放，从而达到细胞内外渗透压平衡。

Sauer T等[4]首次利用“细菌挤奶”技术生产四氢嘧啶，使用盐单胞菌DSM 142在高盐培养基（15% NaCl）中发酵，然后收集菌体转入低盐培养基（3% NaCl）进行冲击并迅速释放胞内的四氢嘧啶，之后将细胞重新转移至高盐培养基诱导合成四氢嘧啶，然后再次低渗冲击，并释放四氢嘧啶。经过9次重复循环后，四氢嘧啶的最终产量为3.3 g/L。姚倩倩[5]曾报道W2菌株能够耐受11轮高/低渗透压反复冲击，且合成量与释放量无明显下降，经过12轮冲击后，四氢嘧啶的产量有所降低，四氢嘧啶的释放量达到5.21 g/L。

然而，生物合成四氢嘧啶的高盐培养基不仅对发酵罐造成腐蚀，而且也会增加下游纯化的难度和废水处理的成本。另外，由于高渗透压和低渗透压的反复冲击，菌体的生长速度减慢，从而降低四氢嘧啶的产量。针对“细菌挤奶”工艺的不足，国内外学者通过以下几个方面进行改造：①筛选高产原始菌株，优化发酵工艺条件，在低盐浓度下实现四氢嘧啶的高产；②传统诱变育种；③构建基因工程菌株，利用转基因非嗜盐菌（大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌）异源合成四氢嘧啶，避免生产四氢嘧啶对高盐条件依赖，简化下游产品纯化过程，提高四氢嘧啶产量。

2.1 筛选高产原始菌株

作为细胞内产物，四氢嘧啶的产量与生物总量有关。为了获得高生产率，需要优化培养条件。Zhang LH等[6]利用DSM 5928在含0.5 mol/L NaCl的10 L发酵罐内分批发酵，四氢嘧啶的产量达到6.9 g/L，表明盐单胞菌DSM 5928在较低NaCl浓度下有效合成四氢嘧啶。Lang YJ等[7]优化发酵工艺，在10 L发酵罐中以0.5 mol/L NaCl、80 g/L谷氨酸钠和pH7.0分批发酵DSM 5928，四氢嘧啶的最高产量达8.21 g/L。盐单胞菌BCRC 17875[8]也被用于四氢嘧啶生产，通过优化搅拌速度和培养基组成，最终以谷氨酸钠为底物获得13.96 g/L四氢嘧啶，产率为0.29 g/L/h。

2.2 传统诱变育种

在最佳培养基和培养条件下，采用人工诱变使盐单胞菌基因突变，改变其遗传结构和功能，筛选出产量高、性能优良的突变菌株。目前，紫外诱变是一种应用较多的人工诱变技术。

田磊[9]采用9轮循环紫外诱变盐单胞菌sp.XH26，发酵培养40 d后，四氢嘧啶的产量较原始菌株提高了2倍以上，均表现出良好的稳定性，其中，突变菌HU09－32的产量高达1351.09 mg/L±17.69 mg/L，是原始菌株的2.9倍。王冠凤等[10]采用紫外和亚硝基胍相结合的方法诱变海神盐单胞菌BAA-805，经筛选获得突变菌株UN-2，通过补料分批发酵制备四氢嘧啶，与原始菌株对比，四氢嘧啶的产率提高了53.8%。

2.3 构建基因工程菌株

近年来，为了满足日益增长的商业需求，研究者通过合成生物学消除基因调控，人工控制基因表达，以典型工业菌株(如大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌)作为底盘细胞，成功地实现了低盐环境下异源高效生产四氢嘧啶，为下一代工业生物技术提供理论基础。

2.3.1四氢嘧啶在大肠杆菌中的异源合成由于大肠杆菌生长速度快，产量高，具有良好的遗传背景，可获得多功能质粒载体，易于扩大生产规模，因此常被用作异源生物转化的载体菌株。

He YZ等[11]将伸长盐单胞菌的四氢嘧啶基因成功导入大肠杆菌BW25113中，在阿拉伯糖诱导启动子的作用下获得异源合成四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌株。以天门冬氨酸和甘油为直接底物的全细胞生物催化工艺中，24 h内可生成25.1 g/L的四氢嘧啶，经过多轮生物转化，最终四氢嘧啶的产量高达63.4 g/L。该技术为四氢嘧啶的生物合成提供了一种可行的方法，具有大规模工业化生产的潜力。Ning YK等[12]引入的基因簇，敲除内源基因和，利用Ptrc取代基因的启动子，构建一株以大肠杆菌W3110为基础无需添加天冬氨酸的产四氢嘧啶菌株。发酵培养30 h后，四氢嘧啶终产量为25.1 g/L。然而，这些关键基因的缺失损害了细胞的生长，导致细菌活力降低。

2021年Wang Y等[13]在无关键基因缺失的情况下，构建一株以大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主高效生物合成四氢嘧啶的重组菌株。通过质粒将的基因簇导入不同的大肠杆菌菌株，利用核糖体结合位点（RBS）序列组合优化对异源基因改造，进一步组合过表达谷氨酸棒杆菌天门冬氨酸激酶突变体(G1A, C932T)和天门冬氨酸半醛脱氢酶以增加前体的供应后，在摇瓶培养中四氢嘧啶产量从0.2 g/L增加到5.5 g/L，采用补料分批发酵，以葡萄糖为唯一碳源，通过合理代谢调控与精准发酵条件控制，四氢嘧啶的终产量增加至60.7 g/L。与四氢嘧啶原始菌株相比，重组菌株具备强适应度、繁殖速度快、高生产力及不易发生菌株退化等优点。

前期虽然可以通过微生物工程菌株发酵生产四氢嘧啶，但仍存在葡萄糖转化率和四氢嘧啶生产效率较低的问题。Zhang H等[14]首先通过引入基因簇并消除赖氨酸合成分支和副产物代谢途径，利用代谢工程技术构建二株高效重组大肠杆菌ET08和ET11。然后，通过优化营养元素和分析转录水平得出，硫酸铵作为最佳氨基供体有效促进四氢嘧啶的合成。随后，优化和的拷贝数来提高四氢嘧啶的产量，充足的EctB为后续的生物合成步骤形成强大的驱动力，重组大肠杆菌ET11 (=1:2:1)摇瓶发酵四氢嘧啶的产量提高至12.9 g/L。当氨基作为供体时，采用分批补料发酵，ET11获得四氢嘧啶的产量高达53.2 g/L。与以往的研究相比，全细胞催化在底物产率上似乎有一定的优势，但需要额外添加甘油和天冬氨酸，导致额外的底物和细胞成本较高。因此，该技术为开发高产四氢嘧啶的生产工艺提供了理论基础，也可用于生产其他高价值氨基酸衍生物。

2.3.2四氢嘧啶在谷氨酸棒状杆菌中的异源合成谷氨酸棒状杆菌（，）是异源生产四氢嘧啶的理想宿主，在生产赖氨酸和谷氨酸等氨基酸方面有着悠久历史。由于赖氨酸和四氢嘧啶生物合成共用ASA作为前体，因此赖氨酸生产菌株可以转化为生产四氢嘧啶的宿主。大量ASA前体化合物可通过过表达反馈抑制天冬氨酸激酶用于生物合成四氢嘧啶和赖氨酸。此外，缺乏大肠杆菌的降解途径，从而避免四氢嘧啶消耗和副产物形成。

由于产赖氨酸菌株LYS-1表达一种抗反馈抑制的天冬氨酸激酶(LysCT311I)，可以合成大量的ASA，是理想四氢嘧啶生物合成菌株。Becker J等[15]利用系统代谢工程，通过启动子表达控制下整合密码子优化合成基因簇，进一步改造碱性谷氨酸棒状杆菌菌株的基因组，并对天冬氨酸激酶进行突变，保证ASA的充足供应。选择编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因作为整合区，降低碳通量，该基因在氨水平较高时，将大部分代谢通量转移到赖氨酸生物合成途径的脱氢酶分支。为进一步阻止赖氨酸产生，敲除编码赖氨酸的基因，阻断赖氨酸分泌，在低盐(0.03 M盐)条件下培养工程菌株ECT-2，最终积累4.5 g/L四氢嘧啶，产率为0.28 g/L/h。Pérez-García F等[16]报道异源表达DM1729分泌四氢嘧啶的生物合成途径。通过删除调节基因和乳酸脱氢酶基因以改善葡萄糖代谢，低盐(0.01 M盐)补料分批发酵工程菌株Ecto5 (DM1729ΔsugRΔldhA)，最终获得四氢嘧啶产量为22 g/L，产率0.32 g/L/h。

Gießelmann G等[17]利用组合质粒文库，对谷氨酸棒状杆菌进行工程改造，使其在低盐条件下通过转录平衡异源生产四氢嘧啶。首先，删除基因以阻断赖氨酸的分泌。其次，采用转录平衡策略，促使高产的四氢嘧啶。与之前使用一个启动子控制基因表达的策略不同，该研究使用19个合成启动子和3个连接子元素，建立包含185,193个突变体的表达文库，协调和的共表达。最后，通过高通量筛选获得谷氨酰胺opt在0.03 M盐浓度发酵56 h，积累65 g/L四氢嘧啶，产率为1.16 g/L/h，比之前报道的重组菌opt的效价高3倍。Jiang A等[18]利用代谢工程和插入式阻遏文库策略，在谷氨酸棒状杆菌中实现了四氢嘧啶的高效生产。首先，将的簇引入K02；其次，对代谢工程进一步优化，包括删除竞争途径(敲除和)和糖酵解抑制因子(敲除)，以及增强前体供应(过表达Ecasd和CglysCS301Y)。最终，设计两个阻遏文库平衡代谢通量，以提高四氢嘧啶产量。最佳菌株CB5L6在5 L生物反应器中补料分批发酵的产量为45.52 g/L，是原菌株的1.79倍。首次利用plug-in阻遏文库对谷氨酸棒状杆菌进行代谢产物构建，为构建微生物细胞工厂提供理论指导。

3 四氢嘧啶的分离提取工艺

诸多研究涉及提高四氢嘧啶产量的方法，然而，关于大规模生产四氢嘧啶的下游工艺却受到很少关注。四氢嘧啶存在嗜盐菌胞内，必须通过粉碎菌体或浸泡溶胀的方式释放四氢嘧啶，随之破碎产生的蛋白等杂质增加了分离纯化的难度。近年来，大多通过膜技术过滤、活性炭脱色、电渗析脱盐、离子交换树脂吸附、浓缩醇沉、冷冻结晶、干燥等步骤来获取四氢嘧啶纯品。

谢希贤等[19]采用双滤膜（微滤膜和超滤膜）去除发酵液中的菌体、部分蛋白和色素，使用阳离子交换树脂吸附，再经氨水洗脱、活性炭脱色、浓缩醇沉，重结晶及干燥获得四氢嘧啶晶体。初期利用膜技术虽然能耗低，但膜孔易被菌体和蛋白阻塞，缩短膜的使用寿命，经济效益降低。谭琳等[20]为实现简易的纯化工艺，获取高收率、高纯度的四氢嘧啶成品，通过构建重组表达载体导入大肠杆菌，利用L-阿拉伯糖诱导表达并进行全细胞催化生产四氢嘧啶，经聚酰胺吸附纯化，浓缩醇沉，重结晶及干燥得到高高纯度的四氢嘧啶。

产品提取方法的类型对下游加工操作产生很大影响，Chen R等[21]利用陶瓷膜过滤、电渗析脱盐，然后再由阳离子交换树脂洗脱、粗产品萃取和三次精制，最后，从水中进一步结晶获得四氢嘧啶纯品。其中阳离子交换和粗产品萃取的平均回收率分别为95%和96%，而在过滤和脱盐过程中分别存在19%和15%的损失率。结合三次精制母液获得最终产品的总收率和纯度平均分别为43%和98%以上。然而，影响生产效率的关键因素不是产量，而是提取粗产品所用的时间，该步骤整体花费24～72 h。为提高四氢嘧啶的结晶收率，李珍爱等[22]提出有机试剂溶析结晶四氢嘧啶浓缩液方案，分析了溶析剂、料液浓度、溶析剂的添加量及搅拌速率对收率的影响。结果表明，在300 r/min的搅拌速率中，6倍发酵液体积的丙酮溶析结晶获得300 g/L四氢嘧啶，一次结晶收率高达94%以上，与降温结晶相比，产率提高40%以上，最终重结晶及干燥后纯度可达99%以上。

为实现大规模生产高纯度和高产量的工业级四氢嘧啶，采用合成生物学方法构建相应的生产菌种，优化生产工艺、降低生产成本、提高合成效率，形成完整的工业技术方案。

4 四氢嘧啶生物学功能及应用

作为一种天然渗透压补偿性溶质，由于四氢嘧啶具有良好的耐受性和安全性，因此在生物保护、化妆品、临床医学、环境修复和新能源等领域，已被开发多种外用产品，具有广泛的应用前景。

4.1 生物保护应用

四氢嘧啶通常不仅保持渗透活性，而且保护细胞、酶和小型水生无脊椎动物免受脱水、干燥、加热和冷冻等恶劣环境胁迫。

4.1.1细胞保护四氢嘧啶与水分子紧密结合，被优先排除在水合物屏蔽之外，导致细胞膜流动性增强，从而有利于细胞应对极端条件，如高温或低温、有毒物质和渗透压改变等。

不同类型的细胞在高温作用下容易产生伴侣蛋白，如热休克蛋白(Hsp)，可以修复错误折叠的肽段。四氢嘧啶在肽链生物合成过程中具有分子伴侣的作用，可以指导新生肽链按特定方式正确折叠，在治疗与蛋白错误折叠相关疾病中发挥着重要作用。Buommino E等[23]报道，用四氢嘧啶孵育的热应激角质形成细胞具有更高水平的Hsp70，并抑制促炎信号产生。四氢嘧啶是低温保存的有效介质。Bissoyi A等[24]研究表明从人脐带血中分离出来的单个核细胞的低温保护培养基，其有效成分包括羟乙基淀粉、四氢嘧啶和辅酶Q10，单个核细胞存活率高达93%。Sun H等[25]报道，四氢嘧啶作为冷冻保护剂用于人内皮细胞系HPMEC-ST1.6R或间充质干细胞的冷冻保存，并在低温中被用作有毒二甲基亚砜(DMSO)的替代品。

四氢嘧啶具有保护细胞防御某些有毒化合物的性能。Bownik A等[26]研究发现，四氢嘧啶预孵育毒素单体的细胞毒性比同时加入细胞悬液毒素单体的毒性要小，这表明四氢嘧啶阻碍毒素单体的展开，从而阻止了细胞膜跨膜孔的形成。

4.1.2稳定酶活性研究表明，四氢嘧啶增加维持水合作用的酶稳定性，从而降低蛋白质变性的敏感性[27]。然而，这种氨基酸衍生物并不直接与蛋白质表面相互作用，而是形成一个分子网，将水分子固定在大分子附近。此外，Roychoudhury A等[28]研究表明，四氢嘧啶可减少因温度快速变化而引起的酶变性。不仅延长乳酸脱氢酶(LDH)和磷酸果糖激酶的活性，而且增加双链DNA核糖核酸酶和聚合酶在高温下的稳定性。

Kolp S[29]报道，四氢嘧啶保护大分子不受蛋白质水解剂的影响。例如，用四氢嘧啶处理过的抗体不易被胃蛋白酶降解。此外，四氢嘧啶可以抑制HIV的复制，也可稳定逆转录病毒载体，用于基因治疗[30]。

4.1.3保护无脊椎动物早期研究发现四氢嘧啶通过抑制热休克蛋白Hsp70、过氧化氢酶活性和NO自由基对大水蚤起保护作用[31]。此外，经四氢嘧啶处理的大水蚤比未处理的对照组更能抵抗消毒剂甲醛和过氧化氢。与单独暴露于H2O2的甲壳类动物相比，暴露于H2O2+ECT组合的水蚤显示死亡率降低，心率和胸肢活动的抑制减弱，GSH/GSSG比率降低较少，CAT活性和NOx水平的刺激较低。因此，四氢嘧啶可以作为不同形式胁迫敏感食用物种运输的稳定剂。

4.2 化妆品应用

四氢嘧啶不仅是细胞中主要的渗透压调节剂，而且可以保护蛋白质、细胞膜和人体组织不受过敏原、紫外线、热和干燥的影响，因此已成为化妆品的理想成分。四氢嘧啶被广泛用于保湿面霜中，可达持久保湿，防止表皮脱水，其效果优于磷脂酰胆碱。由于其对B16-F0和A2058黑色素瘤细胞系的黑色素合成以及细胞酪氨酸酶活性有抑制作用，因此，在相对较低浓度(500 μmol/L)下[32]，四氢嘧啶也可用作增白剂。四氢嘧啶还能缓解皮肤炎症，目前被推荐用于治疗中度特异性皮炎[33]。

Grether-Beck S等[34]报道，四氢嘧啶降低人类角质形成细胞中UVA诱导的神经酰胺信号应答，保护成纤维细胞的线粒体DNA免受UVA破坏，刺激热休克蛋白的产生，从而抑制促炎细胞因子的释放，保护上皮细胞的细胞膜，并防止皮肤受到紫外线的伤害，以达到去皱抗衰的效果。

总之，在化妆品方面，四氢嘧啶具有长效保湿、抗氧化、抗炎、美白以及减少紫外线照射引起的皮肤雀斑或晒斑等作用，其应用逐渐扩展至防晒、保湿、洁面、彩妆、眼部和毛发护理等领域。

4.3 临床医学应用

除了作为渗透保护剂、生物功能稳定剂和皮肤保护剂外，四氢嘧啶也是潜在疾病的治疗药物，包括抗炎、抑制神经退行性疾病等临床医学应用。

四氢嘧啶可有效缓解炎症，临床研究[35,36]表明四氢嘧啶通过抑制纳米颗粒触发的细胞信号传导和IL-8诱导，显著降低纳米颗粒诱导的肺部中性粒细胞炎症及继发性疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病和冠心病等。四氢嘧啶还可保护回肠黏膜免受缺血和再灌注损伤，这是小肠移植术后常见的并发症。炎症反应的缓解与改善肠道屏障和减少细胞因子的产生有关。使用四氢嘧啶作为抗组胺药对过敏患者进行附加治疗，可加速伤口愈合，缓解过敏症状。

最近研究表明[37,38]，四氢嘧啶抗炎治疗被应用于不同剂型，包括含四氢嘧啶的乳霜、鼻喷雾剂、滴眼液和咽喉喷雾剂，分别用于治疗特异性皮炎、过敏性鼻炎和鼻窦炎、干眼症和急性咽炎。以四氢嘧啶为基础的不同剂型在临床中表现出良好的耐受性和安全性，对于希望避免与药物治疗相关局部反应和副作用的炎症患者，它可能是一种可行的替代品。

临床常见的病理过程如淀粉样蛋白的形成和聚集可诱发神经退行性疾病。Kanapathipillai M等[39]报道，四氢嘧啶可以干扰疏水作用和π-π键的相互作用，抑制淀粉样蛋白形成，延缓阿尔茨海默病发展。因此，四氢嘧啶在临床上用于预防阿尔茨海默病、传染性海绵状脑病和帕金森氏病等神经退行性疾病。

4.4 环境修复应用

土壤盐渍化是造成全球农业用地流失和作物产量降低的主要环境因素之一。高盐胁迫主要通过损害光合活性和光合产物的分配来影响植物生长。有关研究表明将四氢嘧啶合成基因簇克隆至烟草细胞中，成功提高盐碱地植物的存活率[40]。四氢嘧啶主要通过两种途径增强烟草的耐盐性。首先，通过维持根部在高盐环境成活，发挥持续吸收水分及运输的功能；其次，通过增加蒸腾作用提高叶片氮源供应，从而提高光合作用效率。Moghaieb R等[41]构建转基因番茄，在盐胁迫条件下，转基因番茄的过氧化物酶活性提高，丙二醛浓度降低，转基因番茄根部的四氢嘧啶合成被促进，导致根部光合产物的库活性加速，细胞膜稳定性增强，光合速率增加。

4.5 新能源应用

微生物燃料电池（MFC）是一种通过微生物作为催化剂氧化有机或无机物质发电的装置。该技术可以将废水回收、污泥减量和良性废水的产生结合起来，是一种新型的废水处理方法。Zeng F等[42]报道，在30 g/L NaCl环境下，将四氢嘧啶直接添加到双极单室MFC的发电基质中，可以提高阳极微生物的耐盐性和发电能力。结果显示TP-MFC在稳定期产生的平均电压为439.3 mV，比普通MFC产生的电压高55.2%。此外，TP-MFC在72 h的脱氮率为63.4%，比普通MFC提高了38.4%。由此可见，四氢嘧啶赋予高盐环境中微生物菌群的耐盐性，从而对微生物燃料电池在高盐有机废水处理中的应用具有重要意义。

5 展 望

四氢嘧啶进入国内外市场引起较高的关注度，2020年全球四氢嘧啶市场销售额达到了2000万美元，预计未来将保持平稳增长的态势，到2027年市场规模将接近3000万美元，年复合增长率（CAGR）为6.6%，且价格高达1000美元/kg，市场前景非常广阔。

由于四氢嘧啶的分子结构携带一个手性碳原子，限于化学合成法存在立体构型选择性低、副产物多等缺点，使得下游纯化过程更加困难，最终导致四氢嘧啶的产量和纯度降低。然而使用生物法制备四氢嘧啶具有特异性高、绿色环保和工艺简单等优点，可以实现工业化生产，利用微生物生产四氢嘧啶受到众多关注。在最近几十年中，为了满足日益增长的商业规模生产需求，在分批发酵、连续发酵、补料分批发酵和细菌挤奶过程中对四氢嘧啶的高产率生产进行生物技术研究。相关研究主要集中于菌株优选和发酵工艺与条件的优化。诸如，传统诱变育种存在的主要问题是有益突变体频率较低，难以有效控制变异的方向和性质。因此提高诱变效率，快速鉴定并筛选突变体，探索定向诱变的途径，成为目前课题研究的重要方向。

随着功能基因组学和合成生物学的快速发展，在非嗜盐底盘中导入和表达四氢嘧啶生产途径获得高产量，而合理调节嗜盐底盘的通量是下一代四氢嘧啶工业生产的一个重要策略。尽管研究已证实转基因大肠杆菌可以有效合成四氢嘧啶，但Dong Y等[43]报道负责四氢嘧啶吸收的脯氨酸运输系统ProP和ProU可能有效地将四氢嘧啶泵出。然而，ProP和ProU缺陷突变体也可以泵出四氢嘧啶，表明这一过程中应该有其他的外排系统参与。此外，排除了大肠杆菌通过非特异性机械敏感通道排出四氢嘧啶的可能性。因此，大肠杆菌分泌四氢嘧啶的机制有待进一步研究，甚至有一些限制可能会阻碍大肠杆菌系统有效地使用过表达异源基因，如密码子的偏颇使用、蛋白质的溶解度、mRNA的稳定性和二级结构。由于异源蛋白中稀有密码子的存在而导致氨基酸取代或帧移突变，最终形成无效产物。因此，为了提高产量和避免传统生物工艺的缺陷，对菌株改良和产生最佳的嗜盐和非嗜盐重组生产菌株仍需进一步的努力。

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Research Progress in Biosynthesis and Application of Ectoine

SUN Xiao-kang, ZHANG Yan-yan, ZHANG Xiao-yuan, LIU Fei1*

,250101,

Ectoine is a cyclic amino acid derivative that protects microorganisms from harsh environments such as high salt, high osmotic pressure and ultraviolet radiation. As an important secondary metabolite of microorganisms, Ectoine has broad application prospects in the fields of biological protection, cosmetics, clinical medicine, environmental remediation and new energy applications. In this paper, the synthesis and degradation pathway, biosynthesis method, biological function and application, separation and purification process of ectoine are reviewed, and the development and industrial application of ectoine are prospected.

Ectoine; biosynthesis; research progress

O611.61

A

1000-2324(2022)06-0976-08

2022-08-10

2022-09-07

山东省重大科技创新工程(2021ZDSYS07);济南市高校院所创新团队项目(2019GXRC038)

孙晓康(1994-),女,硕士研究生,工程师,主要从事生物药物研究. E-mail:1774190401@qq.com

Author for correspondence.E-mail:liufei@sdaps.cn

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.028