徐长卿中的天然产物XCQ-9对Jurkat细胞增殖和凋亡的影响及机制研究 Δ

韦学耐 ，杨坤 ，刘琴 ，赵鹏 ，晏英 ，李艳梅 （1.贵州医科大学药学院，贵阳 55005；.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵阳 550014；.贵州医科大学医药卫生管理学院，贵阳 55005）

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是以未成熟T或B淋巴细胞异常增生为特征的恶性克隆性疾病，根据免疫表型一般分为T细胞型和B细胞型[1]。ALL多发病于2～5岁，是儿童最常见和发病率最高的恶性肿瘤，且其发病率呈逐年上升的趋势[2—4]。其中，急性T淋巴细胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）是一种侵袭性疾病，在儿童ALL病例中占10%～15%[5]。目前临床上治疗T-ALL的化疗药物有长春新碱、柔红霉素、可的松和依托泊苷等，但上述药物具有高毒性和耐药性，这在一定程度上限制了其临床应用[6—7]。且有研究表明，这些化疗药物的耐药性已成为T-ALL患儿复发的主要原因，严重影响患儿的预后[8]。因此，开发新型抗T-ALL的药物是临床迫切需要的。

徐长卿Cynanchum paniculatum（Bge.） Kitag.为萝摩科鹅绒藤属多年生草本植物，以干燥根和根茎入药。其味辛，性温，归肝、肾经，具有祛风化湿、止痛止痒的功能，用于治疗风湿、牙痛、跌打伤痛、风疹、湿疹等病症[9]。现代药理研究表明，徐长卿具有抗菌、抗病毒、调节免疫、抗肿瘤等药理作用[10]。徐长卿中已报道的化学成分有168种，其中C21甾体类成分有47种[11]。本课题组前期对从徐长卿中提取分离得到的C21甾体化合物进行了抗癌活性筛选，发现化合物XCQ-9具有抗人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞的作用，其结构式见图1。本研究拟通过体外实验初步探索XCQ-9对Jurkat细胞增殖和凋亡的影响，并从经典的胱天蛋白酶（Caspase）途径和细胞周期两个方面来考察其可能的作用机制，以期为将XCQ-9开发为治疗T-ALL的药物提供实验基础。

图1 XCQ-9的化学结构

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器有A2型生物安全柜（美国Thermo Fisher Scientific公司）、Microfuge型台式高速冷冻离心机（美国Backman公司）、Axi Vert AL型倒置光学显微镜（德国Zeiss公司）、Synergy2型多功能酶标仪（美国Gene公司）、PowerPacTMBasic型电泳仪（美国Bio-Rad公司）、ACEA NovoCyte型流式细胞仪[艾森生物（杭州）有限公司]、Odyssey&CLX型双色红外成像系统（美国LI-COR Odyssey公司）。

1.2 主要药品与试剂

XCQ-9为本课题组提取制备，分子式为C21H30O2，纯度≥98%[12]；胎牛血清购自美国HyClone公司；RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；Annexin Ⅴ-FITC凋亡检测试剂盒（批号0315976）购自美国BD公司；二甲基亚砜、MTT和二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（批号分别为401P031、810K052、20211213）均购自北京索莱宝科技有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号62u0922）购自美国Affinity公司；兔源细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）、细胞周期蛋白 B1（Cyclin B1）抗体（批号分别为 ab133327、ab32072）均购自美国Abcam公司；兔源Caspase-9、活化的 Caspase-9（Cleaved Caspase-9）、Caspase-3、活化的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly ADP-ribose poly-merase，PARP）抗 体和 Dy-LightTM800标记的抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 细胞株

人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株购买于美国ATCC细胞库，现于本实验室保存。

2 方法

2.1 细胞培养

将Jurkat细胞接种于含5%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，将细胞置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行后续实验。

2.2 XCQ-9对细胞增殖的影响

采用MTT法进行检测。取对数生长期的Jurkat细胞，按1×105个/孔接种于96孔板中，置于培养箱中常规培养。待细胞稳定后，将其分为空白对照组（0 μmol/L）和不同浓度（2.5、5、10、20、40 μmol/L，药物浓度根据前期预实验结果设置）的XCQ-9组，每组平行设置5个复孔。分别干预24、48、72 h后，加入10 μL含5 mg/mL的MTT试剂常规孵育4 h，然后再加入三联液（500 mL三联液中含十二烷基硫酸钠50 g、异丁醇25 mL和浓盐酸0.5 mL）100 μL，孵育过夜。使用酶标仪测定各孔在570 nm波长处的吸光度（A），计算细胞存活率[细胞存活率（%）＝（给药组A/空白对照组A）×100%]。实验重复3次。

2.3 XCQ-9对细胞周期的影响

采用流式细胞术进行检测。取对数生长期细胞，按4×105个/孔接种于6孔板中，常规培养。待细胞稳定后，将其分为空白对照组（0 μmol/L）和不同浓度（2.5、5、10 μmol/L，浓度根据“2.2”项下MTT实验结果设置）的XCQ-9组，每组平行设置5个复孔，置于培养箱中常规培养。干预24、48 h后，以1 000 r/min离心4 min，收集细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入500 μL预冷的70%乙醇固定过夜，再次以1 000 r/min离心4 min去除乙醇，并用预冷的PBS洗涤细胞；加入含0.1 mg/mL RNase、50 μg/mL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）和0.05%Triton-100的PBS，混匀，室温避光染色30 min，上样流式细胞仪测定各组细胞的细胞周期占比。实验重复3次。

2.4 XCQ-9对细胞凋亡的影响

取对数生长期细胞，按“2.3”项下方法接种、分组、给药、培养并收集细胞。用50 μL 1×Binding buffer混匀，并加入Annexin V-FITC和PI各2.5 μL，避光染色15 min，上样流式细胞仪检测和分析。实验重复3次。

2.5 XCQ-9对细胞中凋亡和周期相关蛋白表达的影响

采用Western blot法进行检测。取对数生长期细胞，按12×105个/皿接种于60 mm培养皿中，置于培养箱中常规培养。待细胞稳定后，将其分为空白对照组（0 μmol/L）和不同浓度（2.5、5、10 μmol/L，浓度设置依据同“2.3”项下）的XCQ-9组。干预24 h后收集细胞，用预冷的PBS清洗3次，加入80～150 μL含有1%苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，以12 000 r/min离心15 min，去沉淀得到细胞蛋白溶液。用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，并将5×loading buffer和细胞蛋白溶液按1∶4的体积比混匀，95 ℃变性5 min，-80 ℃保存备用。在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中，每孔加入50 μg蛋白，待蛋白分离完全后（电泳条件为电压100 V、时间2 h），转移（转膜条件为电流220 mA、时间2 h）到0.2 μm的聚偏二氟乙烯膜上，以3%牛血清白蛋白室温封闭1 h；加入相应的一抗（GAPDH、Cyclin B1、CDK1的稀释比例均为1∶5 000，Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、PARP 的稀释比例均为 1∶1 000），4 ℃孵育过夜；Tris缓冲盐溶液（TBS）洗3次、每次5 min，加入DyLightTM800标记的二抗（稀释比例均为1∶30 000），避光室温孵育1.5 h；TBS洗3次、每次5 min，用双色红外成像系统检测和分析。以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

2.6 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，使用GraphPad Prism 9.0软件作图。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 XCQ-9对Jurkat细胞增殖的影响

与空白对照组比较，作用24、48、72 h后，XCQ-9不同浓度组细胞的存活率均显著降低（P＜0.01），并呈时间和浓度依赖性趋势。结果见表1。

表1 XCQ-9干预不同时间后各组细胞的存活率测定结果（±s，n＝5，%%）

表1 XCQ-9干预不同时间后各组细胞的存活率测定结果（±s，n＝5，%%）

a：与空白对照组比较，P＜0.01

组别空白对照组XCQ-9 2.5 μmol/L组XCQ-9 5 μmol/L组XCQ-9 10 μmol/L组XCQ-9 20 μmol/L组XCQ-9 40 μmol/L组72 h 100 72.58±2.40a 50.62±1.59a 34.48±0.56a 27.62±1.26a 22.99±0.14a 24 h 100 82.59±1.45a 74.08±0.73a 61.04±2.41a 60.81±1.51a 61.20±1.55a 48 h 100 77.84±1.45a 59.14±2.07a 44.26±1.59a 38.19±1.34a 33.87±0.94a

3.2 XCQ-9对Jurkat细胞凋亡的影响

与空白对照组比较，作用24、48 h后，XCQ-9 5、10 μmol/L组细胞的凋亡率均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），且呈浓度和时间依赖性趋势。结果见图2、表2。

表2 XCQ-9干预24、48 h后各组细胞的凋亡率测定结果（±s，n＝3，%%）

表2 XCQ-9干预24、48 h后各组细胞的凋亡率测定结果（±s，n＝3，%%）

a：与空白对照组比较，P＜0.01；b：与空白对照组比较，P＜0.05

组别空白对照组XCQ-9 2.5 μmol/L组XCQ-9 5 μmol/L组XCQ-9 10 μmol/L组24 h 6.93±0.88 5.53±0.31 10.19±0.57a 25.64±0.93a 48 h 5.92±1.52 4.48±1.07 12.79±2.99b 34.64±6.25a

图2 XCQ-9干预24、48 h后各组细胞凋亡检测的流式细胞图

3.3 XCQ-9对Jurkat细胞周期的影响

与空白对照组比较，XCQ-9 10 µmol/L组干预24 h后及XCQ-9 5、10 µmol/L组干预48 h后，细胞中处于G2期的比例均显著升高（P＜0.01）。结果见表3、图3。

图3 XCQ-9作用24、48 h后各组细胞周期检测的流式细胞图

表3 XCQ-9干预24、48 h后各组细胞的细胞周期占比测定结果（±s，n＝3，%%）

表3 XCQ-9干预24、48 h后各组细胞的细胞周期占比测定结果（±s，n＝3，%%）

a：与空白对照组比较，P＜0.01

组别24 h 48 h G1期40.71±4.30 39.81±3.02 35.49±3.02 23.87±2.42 G2期17.19±1.13 21.55±2.72 38.70±3.30a 45.31±1.82a S期38.87±2.18 39.20±1.75 29.63±6.37 25.89±1.94 S期38.14±1.98 40.12±2.45 36.44±9.78 24.21±1.61 G2期19.87±6.57 18.87±4.24 32.96±0.69 47.63±3.83a G1期42.63±2.05 37.59±3.16 30.00±3.11 18.07±15.32空白对照组XCQ-9 2.5 µmol/L组XCQ-9 5 µmol/L组XCQ-9 10 µmol/L组

3.4 XCQ-9对细胞中凋亡和周期蛋白表达的影响结果

与空白对照组比较，XCQ-9 10 µmol/L组细胞中CDK1和Caspase-9蛋白表达显著下调（P＜0.01），XCQ-9 2.5、5、10 µmol/L组细胞中Cyclin B1、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01），5、10 µmol/L组细胞中Cleaved Caspase-9蛋白表达显著上调（P＜0.01）。结果见图4、表4。

表4 各组细胞中凋亡和周期相关蛋白表达水平的测定结果（±s，n＝3）

表4 各组细胞中凋亡和周期相关蛋白表达水平的测定结果（±s，n＝3）

a：与空白对照组比较，P＜0.01；b：与空白对照组比较，P＜0.05

组别Cyclin B1/GAPDH CDK1/GAPDH Caspase-9/GAPDH Caspase-3/GAPDH PARP/GAPDH空白对照组XCQ-9 2.5 μmol/L组XCQ-9 5 μmol/L组XCQ-9 10 μmol/L组0.52±0.08 0.79±0.12a 1.04±0.16b 0.98±0.16a 0.46±0.06 0.41±0.04 0.46±0.04 0.16±0.01b 1.26±0.03 1.24±0.08 1.11±0.09 0.76±0.06b Cleaved Caspase-9/GAPDH 0.04±0.00 0.04±0.01 0.23±0.01b 1.03±0.02b 1.28±0.07 1.25±0.04 1.29±0.04 1.31±0.09 Cleaved Caspase-3/GAPDH 0.41±0.03 0.70±0.01b 1.29±0.06b 1.80±0.06b 2.30±0.13 2.22±0.13 2.03±0.09 2.09±0.14 Cleaved PARP/GAPDH 0.51±0.01 0.72±0.06b 0.71±0.04b 0.92±0.01b

图4 各组细胞中凋亡和周期相关蛋白表达的电泳图

4 讨论

肿瘤的发生是由于受到遗传因素、环境因素和基因突变等的综合影响，使得细胞增殖与死亡之间的稳态被破坏，从而导致肿瘤细胞不可控制地生长，因此在研究抗肿瘤药物时，通常将凋亡和周期阻滞作为抗肿瘤效果评价的两大指标[13—14]。本研究发现，XCQ-9可以抑制Jurkat细胞的增殖，同时促进Jurkat细胞的凋亡，并诱导Jurkat细胞发生G2期阻滞。这提示，XCQ-9具有一定的抗白血病活性。

凋亡是由Caspase介导的一种非炎症形式的程序性细胞死亡[15]。其中，Caspase-9活化后（即Cleaved Caspase-9）可以启动Caspase级联反应，使凋亡执行者Caspase-3活化（即Cleaved Caspase-3）[16]。与Caspase家族的其他成员相比，Caspase-3处于Caspase级联的末端，其激活是启动凋亡程序的必经之路，可以水解底物PARP（Cleaved PARP是Cleaved Caspase-3水解的产物，是凋亡的标志），从而抑制DNA修复，使细胞凋亡[17]。本研究结果显示，XCQ-9可上调Jurkat细胞中Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白的表达，这可能是诱导其发生凋亡的重要原因。

细胞周期是由检查点、细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白共同调节的、高度保守的、严格控制的过程[18]。CDK1是细胞周期进程的核心，其失调可导致肿瘤侵袭性发展、染色体不稳定和细胞增殖加强[19]。Cyclin B1在细胞生长发育过程中发挥着重要的作用，在细胞分裂中期达到高峰，在分裂后期下降，被认为是G2期阻滞的标志[20]。本研究结果显示，XCQ-9可下调Jurkat细胞中CDK1的表达，上调Cyclin B1的表达，进一步验证XCQ-9是通过阻滞G2期来发挥作用的。

综上，XCQ-9可通过Caspase途径来促进细胞凋亡，主要通过上调Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白促进细胞凋亡，下调CDK1和上调Cyclin B1蛋白使细胞发生G2期阻滞来抑制细胞增殖，这提示XCQ-9可能是一种具有潜力的抗T-ALL的新型候选药物。但本研究仅在体外研究了该药的抗白血病活性，尚未在体内验证其活性，之后将进一步进行体内实验验证，从而为其应用于临床奠定基础。