连续血液净化对脓毒症患者外周血NLRP3炎症小体及肠道屏障功能的影响*

王鑫 成慧昕 李祥 于湘友 杨春波

(新疆医科大学第一附属医院重症医学中心，新疆 乌鲁木齐 830054)

脓毒症是宿主对感染的反应失调而引起危及生命的器官功能障碍的疾病[1]。抗生素治疗、感染源控制、液体复苏及血管活性药物的应用是目前脓毒症治疗的基石[2-4]，免疫治疗、体外血液净化等疗法也被视为控制脓毒症炎症反应的辅助手段[3,5]。连续血液净化(Continuous blood purification,CBP)可在一定程度上控制机体免疫系统的调节失衡、降低机体细胞因子风暴、减轻脏器功能损伤[6]。然而，大规模的RCT研究及Meta分析提示体外血液净化治疗并未显著改善脓毒症患者的临床预后[7-9]。肠道既是脓毒症的“始动因素”，也是脓毒症器官损伤的靶点[10]。肠道内环境紊乱、微循环障碍、炎性因子风暴、肠道动力障碍、菌群失调及移位等因素共同作用，可加重肠道黏膜屏障的破坏[11]。在内源性及外源性刺激下，NOD样受体家族核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NOD-like receptor family， pyrin domaincontaining 3，NLRP3)炎症小体可通过同型相互作用招募ASC、caspase-1前体激活caspase-1，继而引起促炎介质白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18的成熟及释放，促进炎症反应[12]。现有研究提示，NLRP3炎症小体活化与脓毒症导致的多器官损伤密切相关[13]。脓毒症患者应用CBP治疗对于肠道黏膜屏障功能的研究相对较少,缺乏相应的研究基础，CBP治疗是否影响NLRP3炎症小体的研究缺乏理论支持。因此，本文就连续血液净化治疗对脓毒症患者肠道屏障功能、NLRP3炎症小体及临床预后的影响进行探讨和分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究采用前瞻性研究方法，纳入2019年5月～2021年5月入住新疆医科大学第一附属医院重症医学(ICU)中心的符合Sepsis 3.0标准[1]的脓毒症患者作为研究对象。根据进行CBP治疗将其分为脓毒症常规治疗组及脓毒症CBP治疗组。同时纳入同期入住ICU的非脓毒症患者作为对照组。 纳入标准：年龄≥18周岁；脓毒症组患者符合Sepsis 3.0的诊断标准；入住ICU时间≥3 d；取得患者或患者家属的知情同意；临床资料齐全。 排除标准：患者或家属拒绝；既往存在慢性胃肠道疾病或伴有胃肠道恶性肿瘤；免疫系统疾病患者；入院72 h内死亡或自动出院者；妊娠或哺乳期患者。本研究作为前瞻性研究不对临床治疗进行干预，仅对不同组别的患者进行血液标本的收集，与患者或家属充分沟通获得同意后进行。本研究已通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准(审批号：20200624-14)，并在中国临床试验注册中心进行注册且通过审核(注册号：ChiCTR 2000040813)。本研究共纳入100例，排除ICU住院时间<72 h(4例)、既往存在慢性胃肠道疾病(6例)、伴有胃肠道恶性肿瘤及孕产妇等(7例)，最终纳入83例研究对象。其中非脓毒症组24例、脓毒症常规治疗组35例、脓毒症CBP治疗组24例。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 收集3组患者各时点的第0、1、3天的外周血样本：非脓毒症患者在入住ICU第0、1、3天；脓毒症常规治疗组为诊断脓毒症时的第0、1、3天；脓毒症CBP治疗组则为进行CRRT上机前(第1天)、经上机治疗后第3天(清晨08∶00)进行血液标本的收集。

1.2.2 外周血淋巴细胞RNA提取及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR) RNA提取：相同时间点收集的外周血5 mL，提取外周血淋巴细胞中的NLRP3炎症小体相关指标的RNA。引物的设计由生工生物工程(上海)股份有限公司在线设计。RT-PCR：应用SYBR法,体系为20 μL。混合引物为1.2 μL，2×SuperReal PreMix 10 μL，cDNA模板100ng，添无酶水至20 μL(所有操作均在冰上进行)。应用2-△△CT法计算NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC以及GAPDH的mRNA表达。

1.2.3 酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法测定血清相关指标 严格按ELISA试剂盒(武汉华美公司)说明书步骤操作，应用酶标仪进行测定及分析。测定指标包括肠道损伤指标血清肠型脂肪酸结合蛋白(Serum intestinal fatty acid binding protein，I-FABP)、炎症因子IL-1β、IL-18的水平。

1.2.4 其他资料 IL-6、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、肌酐、BUN等采用新疆医科大学第一附属医院检验中心的数据。同时记录入住ICU 24 h急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(APACHE Ⅱ)、入住ICU24 h内及第3天(或血液净化治疗后)的急性胃肠功能损伤 (Acute gastrointestinal injury，AGI)评分、年龄、基础疾病等。电话随访患者28 d生存情况。

2 结果

2.1 3组患者一般资料比较 3组患者在性别、BMI、基础疾病(糖尿病除外)、感染部位(非脓毒症组颅内感染占比较高)等方面比较差异均无统计学意义(均P>0.05)；与非脓毒症组相比，脓毒症组常规治疗、CBP治疗年龄较小(P<0.05)；而脓毒症CBP治疗组的APACHEⅡ评分及28 d死亡率等方面明显增高，差异具有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 3组一般资料情况对比Table 1 Comparison of general information at ICU admission

2.2 3组患者临床指标比较 组间比较：患者第1天与第3天，3组患者APACHEⅡ评分、PCT、IL-6、肌酐、BUN比较差异具有统计学意义(均P<0.05)，治疗后第3天，3组患者血清NE%水平比较差异亦具有统计学意义(P<0.05)。组内比较：第3天非脓毒症组患者CRP较第1天显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，第3天脓毒症常规治疗组、脓毒症CPB组患者血乳酸含量较第1天明显降低，且脓毒症CPB组患者BUN相较于第1天明显下降(P<0.05)，然而其余指标第3天较第1天相比，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 3组患者常见临床指标的比较Table 2 Comparison of common clinical indicators in each group

2.3 3组患者外周血淋巴细胞中NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC的基因表达情况 组间比较：第1天，脓毒症常规治疗组和脓毒症CBP治疗组的NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC的mRNA水平较非脓毒症组显著升高，差异具有统计学意义(均P<0.05)。 组内比较：脓毒症常规治疗组患者第3天的NF-κB p65及NLRP3炎症小体的mRNA水平较第1天相比有所升高，差异具有统计学意义(均P<0.05)，第3天脓毒症CBP治疗组患者各指标较第1天均有显著下降，差异具有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

表3 3组患者PBL中NF-κB p65、NLRP3炎症小体的mRNA水平比较Table 3 Mrna levels of NF-Κb P65 and NLRP3 inflammatory bodies in PBL of each group

2.4 3组患者外周血IL-1β、IL-18的水平 组间比较：第1天，脓毒症CBP治疗组的IL-1β与IL-18的水平显著高于非脓毒症组(均P<0.05)，而与脓毒症常规治疗组相比，仅有IL-18的水平较高(P<0.05)。第3天时，脓毒症CBP治疗组的IL-1β与IL-18均显著高于非脓毒症组；与脓毒症常规治疗组相比，脓毒症CBP治疗组的IL-1β有明显增加。组内比较：脓毒症常规治疗组、脓毒症CBP治疗组第3天IL-18的水平较第1天均显著降低(均P<0.05)，且脓毒症CBP治疗组患者第3天IL-1β水平较第1天下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。非脓毒症组患者第1天与第3天各项指标比较差异无统计学意义(均P>0.05)。见表4。

表4 3组患者外周血IL-1β、IL-18的水平比较[M(P25,P75)，ng/L]Table 4 Comparison of il-1 β and IL-18 levels in peripheral blood

2.5 3组患者外周血I-FABP、AGI评分的比较 组间比较：脓毒症常规治疗、脓毒症CBP治疗组的I-FABP水平、AGI评分较非脓毒症组均明显增加(均P<0.05)；而脓毒症CBP治疗组的AGI评分在上述时点均显著高于脓毒症常规治疗组(均P<0.05)。 组内比较：非脓毒症组与脓毒症常规治疗组第3天各指标较第1天升高，但仅有脓毒症常规治疗组患者I-FABP水平变化差异具有统计学意义(P<0.05)，脓毒症CBP治疗组第3天的I-FABP水平与AGI评分较第1天明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表5。

表5 3组患者I-FABP、AGI评分的比较[M(P25,P75)]Table 5 Comparison ofI-FABP and AGI scores in each group

3 讨论

脓毒症是重症医学领域研究的常见病、多发病，对国家、社会及家庭造成了沉重的负担，严重威胁人民的健康福祉。2020年我国ICU内脓毒症的发病率为20.6%，较2014年发病率有所下降，但90天病死率仍高达35.5%[14]。研究发现NLRP3炎症小体在脓毒症所造成的肾、肝及肺等脏器损害中具有重要作用，近年来越来越多的研究将其做为脓毒症治疗的靶点之一[12,15]。本研究发现脓毒症患者血清中IL-1β、IL-18均明显高于非脓毒症者，这与Garnacho等[16]得出的研究结果一致，进一步说明NLRP3炎症小体活化参与脓毒症发生发展。此外，本研究发现相较其他两组，脓毒症CBP治疗组在上机前、上机后3天I-FABP、AGI评分显著增高，同时NLRP3炎症小体的mRNA的表达水平也进一步增加，提示脓毒症疾病进展造成的胃肠道功能障碍可能与NLRP3炎症小体活化有关。既往的研究也对此观点进行论证，研究发现脓毒症动物模型发生肠道屏障功能障碍时，存在肠道组织中的NLRP3炎症小体表达升高[17-18]。同时Feng等[19]在抗生素诱导的肠道损伤的模型中发现， NLRP3炎症小体在活化的同时伴有肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1降低，因此脓毒症肠道功能障碍可能与肠道连接蛋白Occludin、Claudin-1表达减少及NLRP3炎症小体活化有关。

目前，血液净化治疗已成为重症患者重要的辅助治疗手段，在临床工作中应用广泛，本研究发现脓毒症CBP治疗组经过治疗后IL-6有所降低，但与上机前相比并无明显差异，可能与本组患者的疾病仍处于进展当中或纳入的样本量过少有关。本研究结果显示血液净化降低了外周血淋巴细胞中的NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC的水平，提示血液净化治疗可以有效清除外周血淋巴细胞中NLRP3炎症小体的水平。Bellomo等[20]于1993 年发现应用CVVHDF(持续静脉-静脉血液透析滤过) 可显著降低脓毒症合并急性肾衰竭患者的炎症因子水平，如TNF-α、IL-1β。但Cole等[21]应用CVVH(2L/h)治疗脓毒症休克或存在器官功能不全的脓毒症患者，结果提示许多炎症因子水平降低与是否应用CVVH无关。但Zuccari等[22]在对脓毒症/脓毒性休克患者应用CytoSorb进行CRRT治疗中仅发现了IL-8明显降低。一项纳入22个国家130个中心的研究提示， CytoSorb(CS)吸附柱的应用可能降低脓毒症患者IL-6的水平，但该研究观察到的死亡率高达为65%[23-24]。

本研究发现脓毒症CBP治疗组的I-FABP、AGI评分较上机前有明显的降低，提示连续血液净化治疗可能改善患者胃肠道功能，可能与其清除炎症介质、减轻机体负荷有关与须欣等[25]的研究相符。此外，终末期肾病患者采用组合式血液净化模式(HD+HDF+HP)可显著降低终末期肾病患者炎症因子水平，并可能通过改善体内微炎症状态来提供更好的肠道菌群多样性，提示血液净化对肠道具有一定的保护作用[26]。

本研究脓毒症CBP治疗组的28 d存活患者仅为29.17%(7/24)，明显低于脓毒症常规治疗组，但该组患者APACHEⅡ评分较高及临床结局较差，这可能与患者应用血液净化启动时机、感染严重程度以及其他脏器功能障碍等有关。血液净化对脓毒症患者的预后等方面由于本研究样本量较少，亟需更多的RCT研究，以期明确血液净化在脓毒症中应用的价值。

4 结论

脓毒症血液净化治疗可能减少外周血淋巴细胞中 NLRP3 炎症小体的活化，继而减少脓毒症患者体内炎症因子水平，改善脓毒症患者胃肠道屏障功能。