高效液相色谱法同时测定栀子中四类活性成分含量的方法探讨

李少华

武夷学院康复治疗系

马健锦

福州市市场监管监测服务中心

范世明*

福建中医药大学药学院

栀子主产于我国南部地区，目前全国栽培面积约1.7 万公顷[1]，尤以江西、福建等省所产量大质优，为道地产区[2]。作为常用中药材，其质量与临床疗效及用药安全息息相关。传统上栀子以“皮薄、饱满、色红黄者” 为优[2-3]，主要以外部特征对栀子品质进行评判，具有简便高效的特点，但主观性较强，且不能准确说明中药材的品质。因此，当代栀子质量研究除强调传统的性状鉴别外，更加强了对栀子特征性活性成分的研究[3-6]。

近年来研究表明不同产地、不同采收时间、不同用药部位、不同炮制工艺等影响栀子品质关键因素与化学成分差异间具有较大的关联度。如田瑞华等[3]采用高效液相色谱特征图谱法，对江西、福建等3 个产区的栀子进行分析，各产区栀子中的环烯醚萜类成分无明显差异，藏红花素成分、酚酸类成分质量表征差异较大。王雨婷等[7]采用高效液相色谱联用质谱法对安徽、江西等5个产区的栀子进行研究，发现江西产区栀子的京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷酸、绿原酸等成分含量具有优势。罗静玲等[8]对不同成熟期栀子果中栀子苷等4 种活性成分进行测定，发现不同成熟期西红花苷Ⅰ及栀子酸含量差异显著。付小梅等[9]通过检测不同采收期栀子中 8 种成分的含量，发现4 个环烯醚萜类成分及绿原酸均随着果实的成熟呈缓慢下降的趋势，3 个西红花苷随着果实的成熟呈急剧上升，西红花苷Ⅰ与栀子颜色及成熟度呈强相关性。此外雷磊、楚越等[10-11]研究认为炮制工艺对栀子化学成分改变有较大影响。

上述研究的基础均是建立在可靠稳定的栀子有效成分含量分析方法之上。目前文献报道栀子活性成分主要包括环烯醚萜、藏红花素、酚酸及黄酮等四类成分，但当前报道的高效液相色谱含量测定方法主要关注环烯醚萜类、藏红花素类及酚酸类成分[3,7-9]，黄酮类成分报道较少，为更加全面客观评价栀子质量，本文建立了同时测定栀子中环烯醚萜、藏红花素、酚酸及黄酮等四类13 种活性成分液相分析方法，以期为栀子质量研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪配DAD 检测器（美国安捷伦公 司）、SQP SECURA2250-1CN 十万分之一分析天平(德国Sartorius 公 司)、Milli-Q 纯 水机（美国Millipore 公司）、DS-8510 DTH 超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司）、TGL-16B 离心机（上海安亭科学仪器厂）、移液枪（德国艾本德公司），上述仪器均经福建省计量科学研究院校准。

1.2 对照品

栀 子 苷（ 批 号：Z-003-180222，纯度：＞98%）、京尼平苷 酸（ 批 号：J-015-170504，纯度：＞98%）、西红花苷Ⅰ（批号：X-002-171228，纯度：＞98%）、西 红 花 苷Ⅱ（ 批 号：X-003-180731，纯度：＞98%）、藏红花酸（批号：Z-052-180426，纯度：＞98%）、石吊兰素（批号：S-028-181216，纯度：＞98%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；绿原酸（批号：L-007-181112，纯度：＞98%）、新绿原酸（批号：X-014-180410，纯度：＞98%）、隐绿原酸（批号：Y-067-180425，纯度：＞98%）购自成都曼思特生物科技有限公司。山栀苷（批号：PF220520-12，纯度：＞98%）、京尼平龙胆双糖苷（批号：PS220103-16，纯度：＞98%）购自美国Stanford Chemicals 公 司；芦丁（批号：DRE-6880000，纯度：94.56%） 购 自 德 国Dr.Ehrenstorfer 公司；槲皮素（批号：100081-201610， 纯 度：99.1%）购自中国食品药品检定研究院。

1.3 试剂与样品

乙腈（色谱纯）；无水乙醇（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；水为超纯水。栀子样品购于福建省福州市各零售药店及安徽省亳州市药材批发市场，经福建中医药大学药学院范世明正高级实验师鉴定为茜草科植物栀子Gardenia jasminoidesEllis 的干燥成熟果实，详细信息见表1。

表1 栀子样品信息表

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备

分别精密称取上述13 种对照品约10mg，置于10ml 容量瓶中，用75%甲醇溶解至刻度（芦丁常温下在甲醇中溶解度不如乙醇，该标样使用乙醇溶解），得浓度为1mg/ml 的标准储备液（栀子苷为10mg/ml）；分别吸取各标准储备液适量，加入10ml 容量瓶中以75%甲醇定容，制成约20μg/ml 的混合标准液。

2.1.2 供试品溶液制备

精密称取栀子粉末（过五号筛）0.4g，置25ml 容量瓶中，加入75%甲醇溶液适量，振摇后超声处理60min，放冷至室温后再定容，摇匀后吸取适量混悬液离心4min（10000rpm），取上清液经0.22μm 有机滤头滤过，即得。

2.2 色谱条件

以0.1 % 磷酸水溶液为流动相A 相，乙腈为流动相B 相，梯度洗脱，梯度洗脱程序：0min，95%A ；0～8min，95% → 91%A ；8～16min，91% →82%A ；16～24min，82% →72%A ；24～32min，72% →64%A ；32～48min，64% →40%A ；48～53min，40% →10%A ；53～57min，10%A；57～60min，10%→95%A；后运行6min。色谱柱为中谱科技RD-C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流 速 为1ml/min；柱温为30℃；检测波长：藏红花酸为230nm，栀子苷、山栀苷、京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷为237nm，芦丁、槲皮素为256nm，绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、石吊兰素为330nm，西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ为440nm；进样体积10μl，各成分分离度良好，色谱图见图1。

图1 栀子液相色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性考察

用75%甲醇将混标液稀释成0.1～20μg/ml 系列混标工作液（栀子苷1～2111.6μg/ml、京尼平龙胆双糖苷0.1～385μg/ml、山栀苷0.1～140μg/ml、西红花苷Ⅰ0.1～149μg/ml、石吊兰素0.05～20μg/ml），详见表2。以混标溶液中13 个成分实际浓度为横坐标，检出峰面积为纵坐标，进行线性回归拟合，由R2可知，各成分在线性范围内浓度与峰面积相关性良好。

表2 四类13 种活性成分线性范围、线性回归方程、R2

2.3.2 精密度

将供试品溶液，连续进样8次，以峰面积分别计算各组分RSD 值分别为0.59%～3.61%，说明本方法精密度良好，结果详见表3。

2.3.3 稳定性

将供试品溶液，室温下分别于 0，2，4，8，12，18，24h进样测定。以峰面积分别计算24h 各组分稳定性，RSD 值介于1.19%～3.62%，说明样品溶液24h 内较为稳定，结果详见表3。

2.3.4 重复性

按“2.1.2” 项 下 方 法，连续制备8 份栀子供试品溶液，各组分平均含量分别为3.71～55412.17μg/g，RSD 分别为0.41%～2.87%（见表3），表明方法重现性较好。

2.3.5 加标回收率

取供试品6 份，每份0.2g，精 密 称 定， 参 照“2.3.3” 项下栀子含量，精密加入栀子苷等四类13 种对照品适量，按“2.1.2” 项 下 方 法 制 备， 测定。各成分平均加标回收率在95.27%～104.61% 之 间，RSD在0.59%～3.65%之间，详细结果见表 3。

表3 精密度、稳定性、重复性表加标回收率（n=6）

2.4 样品测定

对收集的21 批次样品粉末，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按本方法中色谱条件进行检测，计算样品中13 个活性成分的含量，结果表明：环烯醚萜类含量＞藏红花素类含量＞酚酸类含量＞黄酮类含量，以环烯醚萜类栀子苷含量最高，其次为藏红花素类西红花苷Ⅰ，测定结果详见表4。通过分析以上数据可知，该方法可应用于栀子中四类13 种活性成分的分析检测。

表4 栀子样品中各成分含量测定结果（n=3，μg/g）

3 讨论

3.1 样品溶液制备

考虑研究中多组分极性差异较大，本研究比较了不同浓度的甲醇与乙醇的提取效果，在相同条件下，使用75%乙醇作为溶剂提取上述成分时，山栀苷约53%，新绿原酸约68%，隐绿原酸约82%，但栀子苷、槲皮素提取率可达104%、120%，而75% 甲醇各成分提取率在90%～110% 之间，较为均衡，最终选择以75%甲醇作为提取溶剂。同时，比较了不同超声时间对提取的影响，超声60min 比30min 提取率均有不同程度提高，且重复性实验RSD 更低，此外，超声过程中应注意控制水温，尽量不超过60℃以免成分损失。

3.2 对照品溶液的保存

实验中发现隐绿原酸、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ等对照品溶液即使在冷藏状态下，72 小时后仍会逐渐分解，隐绿原酸会逐渐转为新绿原酸及微量绿原酸；西红花苷转换成分未知。因此，上述成分对照品溶液建议即配即用，不可长期保存使用。

3.3 流动相的选择

本实验比较了甲醇-0.1%甲酸，甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%甲酸，乙腈-0.1%磷酸为流动相，由于检测成分基质较为复杂，采用了梯度洗脱，实验中含量0.1%的甲酸或磷酸水溶液均可以作为流动相对成分进行分离，但甲酸水溶液在梯度比例急速增大时，基线产生剧烈波动，不如磷酸稳定。考虑乙腈末端吸收波长较优于甲醇，因此，选择以乙腈-0.1%磷酸体系为流动相，并进一步优化流动梯度，可使得目标组分基线分离，且分离效果良好。

3.4 波长的选择

通过查阅参考文献报道及实验确证（图1）环烯醚萜类（栀子苷、山栀苷、京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷）波长确定为237nm，酚酸类（绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸）波长确定为330nm；西红花素类（西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ）波长确定为440nm，黄酮类（芦丁、槲皮素）波长确定为256nm。本研究中藏红花酸在230nm 吸收度最大；石吊兰素在280nm、330nm 均有较大吸收，因此将其与酚酸类共用330nm。