环境DNA在渔业资源调查中的应用研究进展

郑德斌，马 超，刘张倩，栾 凯，陈 卫，刘克奉

（天津市水产研究所 天津 300221）

引言

渔业资源调查是保护和管理渔业资源的重要手段。传统的调查方法包括捕捞调查、捕捞统计和水生生物监测等。然而，传统方法通常具有操作繁琐、耗时长、成本高等问题，很难获取全面准确的数据，特别是对于水体中的隐蔽鱼类或少量目标种的调查。因此，寻找一种快速、准确且非侵入性的渔业资源调查方法具有重要意义。

环境DNA 技术作为一种新兴的非入侵性调查方法，已经在渔业资源调查中得到广泛应用。所谓环境DNA技术，指利用对环境中游离DNA分子研究和分析，从而检测出存在的目标物种种类和布局，从而为渔业资源的保护和管理提供重要信息。环境DNA技术的应用研究在渔业资源调查中取得了一定的进展。研究人员通过收集不同水体中的样本，如河流、湖泊、海洋等，利用环境DNA技术可以检测到目标鱼类的存在和相对丰度，从而研究其分布与数量变化。与传统调查方法相比，环境DNA 技术具有快速、高效、准确的优势，且能够发现隐蔽种、少量种和稀有种，为渔业资源的保护和管理提供了新的视角。此外，环境DNA 技术还可以用于评估鱼类生存环境质量和生态系统健康状况。通过分析水体中的环境DNA，可以确定有害物质的污染程度，评估环境对鱼类的适应性，并提供有关生态系统功能和稳定性的信息。

1 环境DNA水样检测方法

当前，可以通过三种取样方法来调查鱼类资源和检测鱼类资源，如：直接采集法、滤膜法和沉淀法等环境DNA技术。

（1）直接采集法：将采集的水样直接保存起来，以收集其中的环境DNA。这种方法相对简单，适用于场地条件较为便利的情况。

（2）滤膜法：将采集的水样通过过滤的方式，将环境DNA 滤附于滤膜上，然后保存滤膜以采集DNA。滤膜法又可分为三种具体操作方式：①在线过滤：在野外进行实时过滤操作; ②采样后过滤：在野外进行非实时过滤操作;③水样采集-保存-实验室过滤：采集水样后将其保存，并在实验室中进行过滤操作。在滤膜法中，常见的滤膜材料孔径往往在0.22～1.5 μm 范围之内，有硝酸纤维膜、聚碳酸酯膜、玻璃纤维膜和尼龙膜等。据已有研究可知，不同滤膜的DNA回收率是不同的，回收效果最佳的是混合纤维滤膜。为保证DNA 的稳定性，往往采用冷冻保存或脱水保存滤膜的方式。冷冻保存在-20℃，而脱水保存则是通过3 mol/L的乙酸钠和95%的乙醇（或无水乙醇）混合液以进行脱水处理。

（3）沉淀法：沉淀法是一种分离和浓缩环境DNA的方法，分为乙醇沉淀法和异丙醇沉淀法。采集水样时，将药品和水样按比例混合，然后在低温条件下离心，去除上清后提取沉淀中的DNA。卢珊[1]通过实验研究发现，与乙醇沉淀法相比，异丙醇沉淀法更高效、更稳定，操作方法更简便，需要试剂量少。但是，当野外采样的水样量较大，且目标距离较远的时候，运输和保存会有困难。滤膜法在这方面具有优势，可以过滤保存大量的水中游离的DNA。但是滤膜法也会丢失一些可溶性DNA，这些DNA可能会提高检测率。

采集的环境DNA 水样量通常在15 mL～10 L 之间，具体取决于水体类型和环境条件。海洋、江河、溪流、池塘和湖泊等水体一般采样量为1～2 L，在选择采样方式的时候，应当参考目标物种的生活习性、种群密度和水体环境等因素。增加采样次数、采样点和采样区域，同时在混合采样前分层或河段取样，可以显著提高目标物种的检测率。已有研究发现，重复采样次数对物种的检测率有显著影响，减少重复次数会降低物种的检测率。

环境DNA的降解速率会影响物种的检测率和分布情况。一些研究发现，鱼类离开水体后，水中的环境DNA半衰期为6.3 h；而其他研究发现，移除物种后，环境DNA在水中可存在3 d，还有研究发现环境DNA的存在时间为8 d。这些不一致的结果表明，环境DNA降解速率受到多种因素的影响，如：酸碱性、温度、光照和微生物等。这些因素通过环境DNA释放和降解速度来影响生物量测量的准确性。但是，仍应当加强对环境DNA存在时间长短的研究和分析。

为了提高野外采集水样物种检出率，可以采取以下措施：（1）选择合适的采样方法和采样地点：根据不同水体中的物种多样性，选择适宜的采样方法，并在同一采样位置的同一水体深度设置不同的水量梯度，以增加样品的多样性；（2）及时保存采集的样品：采集的水样需要及时保存，以防止DNA降解导致实验误差。可以使用冷冻保存或添加保护剂等方法来保护采集的样品；（3）优化环境DNA 提取方法：由于水样中的DNA 含量少且成分复杂，尚无统一的环境DNA提取标准。常见的方法是使用微量DNA提取试剂盒进行提取。根据不同研究对象，可以选择不同的组合方式，如水样采集、水样抽滤或离心沉淀以及DNA提取过程等，以提高提取效果；（4）引物设计和目标物种检测：在环境DNA中，有多个生物的DNA，可通过特定引物来增加目标物种的DNA研究，利用二代测序技术检测物种种类。在设计引物的时候，要联系环境DNA复杂的环境条件，引物应适用于不同物种当中，且具备一定的特殊性。目前已经设计出一些针对多种环境DNA的通用引物，为环境DNA技术在物种调查中的应用奠定了基础。常用的引物包括D-Loop 区、16S rRNA 基因、12S rRNA基因、CO1基因和Cytb基因等。

2 检测平台

第1 代测序技术，如Sanger 测序，拥有高度准确和可靠的特点，但是成本较高，速度较慢。而第2代测序技术，如Roche/454 焦磷酸测序、Illumina/Solexa 聚合酶合成测序、ABI/SOLiD连接酶测序和IonPGM测序，则成为主要的测序方法。每种技术都有不同的测序原理，因此产量、质量和成本也存在差异。Roche/454 焦磷酸测序具有最长的读长，但通量较低；Illumina/Solexa聚合酶合成测序具有最高的通量，但读长较短；ABI/SOLiD 连接酶测序适用于重测序，但读长最短；IonPGM 测序则成本较低。Roche/454焦磷酸测序曾经占据主要市场，但随着其他测序技术的发展，这一优势不断削弱。当下，Hiseq 测序平台是第二代测序方法中使用频率最高的，片段读长较短是这一方法的一大短板。

当下，第三代测序技术正逐步发展壮大，其测序方法有并行单分子合成测序、基于荧光共振能量传递测序、纳米孔单分子测序、单分子实时合成测序、半导体测序等单分子。不同于第二代测序技术，三代测序技术是基于SBS原理，即边合成边测序方法，这一方法大大优化了文字构建流程，减少了对PCR扩增的依赖。此外，这一技术也减少了DNA扩增需求，大大提高了测序长度，可达到10～25 kb，并使后续的拼接工作更加简单。

第三代测序技术不仅适用于已知基因组的测序，还可用于未知基因组的测序。然而，第三代测序技术也存在一定的局限性，如错误率较高，不适合重复测序。当下，采取的修正方法的基础多为多次重复测序或第三代测序的长片段，使用第二代测序数据进行修正。尽管第三代测序技术各有优势和不足，但市场上仍主要使用第一、二代测序技术。

可以预见，未来随着第三代测序技术的持续改进，可能会涌现出新的技术，为科学研究提供更为强大的支持。

3 环境DNA技术的研究现状

环境DNA 监测相较于传统的物种调查方法更具优势，其中包括快速降解、实时反映生物状态、短时间、低成本和高检测率的特点。此外，环境DNA采样方法和分析方法便于标准化，其受到工作人员和抽样强度概率较低，且基本不会影响生态系统。此外，环境DNA对于获得许可珍稀或濒危物种的监测更有利。对于监测效果而言，环境DNA在监测多样性上效果明显，能够迅速获得物种分布信息，应用前景广阔。

3.1 环境DNA技术国外研究现状

环境DNA 在2008 年首次被Ficetola 应用于水域入侵物种的监测，即监测美国牛蛙（Rana catesbeiana）。此后，便被广泛应用于研究淡水生态系统的生物，尤其是用于对入侵物种的研究。Ogram A 等[2]研究者表明，在灵敏性和取样效果方面，环境DNA研究效果明显好于传统形态学识别检测方法。J Yoccoz等研究表明，相较于传统渔业监控方法，环境DNA检测方法在研究河流系统中的亚洲鲤鱼效果更佳，并且对北美五大湖的这两种入侵物种进行了扩展研究，进一步证明了环境DNA在监测敏感度方面优于传统的鱼类资源调查方法。此外，Mahon等[3]利用环境DNA检测到河流中低密度下的入侵物种鲤科鱼类，并采取了相应的清除措施。

Martellini A 等[4]使用环境DNA 技术对日本内陆和周围岛屿上的蓝鳃太阳鱼进行了评估，发现了这种入侵物种的存在情况，与传统的视觉检测相比，环境DNA 检测方法更为有效，并通过克隆法和Cytb 部分序列法检测河流中鱼类时，成功发现了4 种鱼类。环境DNA 技术发展水平越高，应用范围也越来越广，被用于研究和评估生物量中，其研究对象范围也不断扩大，包括两栖类、鱼类、哺乳类、爬行类和腹足类。随着测序技术的不断进步，环境DNA 技术现在可以在动物群水平进行物种鉴定，而不仅仅局限于单个物种。Ficetola等[5]利用环境DNA技术在日本近海检测到了128 种鱼类，比较了在鱼类和两栖类物种多样性研究中，环境DNA 技术和传统调查方法的优劣。他们发现，根据多数采样点结果显示，在鱼类种数检测方面，环境DNA检测水平明显不低于传统方法。而在两栖类动物检测方面，环境DNA检测成功率明显高于传统方法。

3.2 环境DNA技术国内研究现状

虽然我国在水环境DNA研究方面起步较晚，但近年来取得了一些重要的研究成果。例如，刘军等[6]选择了根据鱼类5 个线粒体基因设计的环境DNA 通用引物，以鲤科鱼类为研究对象，评估不同引物检测效果可知，在适用性方面，16SrRNA 基因引物明显更符合我国鱼类群落结构环境DNA研究。徐念等[7]检测到了长江中下游干流的24个采样点中的10种鱼类序列，并开发了适用于长江鱼类的环境DNA检测体系。马竹欣[8]则利用环境DNA的方法研究了元阳梯田中克氏原螯虾的分布情况，为监测其扩散动态提供了基础数据。赵梦迪[9]使用12SrRNA 引物研究了黄海近海水域鱼类群落，共检测出571种鱼类，大多数种类是常见或被历史记录过的种类。并对水环境中游离DNA进行了系统研究，通过高通量测序方法全面分析研究了水环境中的DNA情况，是研究水环境DNA的重要前提和基础。吴昀等[10]的研究，则是通过使用环境DNA 检测技术监测长江江豚，江豚曾出现的地方中均可检测到其DNA序列，其中33.33%采样点是没有观测过江豚的采样点发现了江豚序列。综上可知，在物种监测方面，环境DNA比传统监测方法更具优势，准确性、可靠性和灵敏性上更高。由此可知，在鱼类资源调研方面，环境DNA技术为之提供了新方法和新路径。

4 环境DNA技术的优势

对比传统调查方法，环境DNA技术更加依赖实验室内工作，大幅的压缩了野外调查和取样的工作。不仅如此，环境DNA在成本和检测效果方面有着更大优势。

4.1 成本优势

4.1.1 采样成本低

相比传统的渔业资源调查方法，环境DNA调查的采样成本较低。传统的渔业资源调查方法通常需要大量的人力和物力投入，例如使用渔网、罗盘和鱼饵等工具，需要耗费大量的时间和人力来捕捉目标鱼类。而环境DNA调查只需采集水样即可，无需进行物种特异性的捕捉，从而节省了大量的人力和物力成本。

4.1.2 测序成本逐渐降低

随着高通量测序技术的不断发展和成本的降低，环境DNA 调查的后续分析和检测成本也在逐渐降低。通过测序分析，可以从采集到的水样中提取出环境DNA并进行物种鉴定。过去，测序成本较高，限制了环境DNA调查的广泛应用。然而，随着测序技术的成熟和成本的降低，现在可以通过高通量测序平台进行大规模的环境DNA分析，降低了每个样本的检测成本。

4.1.3 数据处理成本低

环境DNA 调查生成的数据量较大，但相对而言，数据处理成本较低。传统的渔业资源调查方法可能需要对大量的样本进行人工鉴定和统计分析，这需要耗费大量的时间和人力成本。而环境DNA 调查可以通过计算机程序自动化地进行物种鉴定和数据分析，大大降低了数据处理的时间和成本。此外，环境DNA调查还可以利用现有的物种DNA数据库进行物种鉴定，进一步节省了数据处理的成本。

4.2 检测效果优势

检测水生生物的入侵对于及早采取控制和消除措施非常重要。但是，早期水域入侵动物数量并不多，且水域当中有着较多的障碍物，这就影响了传统检测方法监测效果，其实用率较低，难以发现一些个体较小的动物。以曹英华等[11]研究为例，他们比较传统监测方法和环境DNA 技术在检测入侵法国西南部的美洲牛蛙的灵敏性。研究结果发现，在38 个采样地点中，环境DNA 技术检测到了美洲牛蛙的存在，而传统调查方法只有7 个地点发现，由此可知，传统方法大大低估了美洲牛蛙的分布情况。在调查美国五大湖中鲢和鳙的入侵情况时也发生类似的情况。

4.3 其他优势

环境DNA 相较于传统的捕捞或电击调查等监测方式具有较少的环境破坏性。传统调查方法在进行监测时可能会对环境和生物造成损伤，但是，环境DNA 仅需要环境水样，对生物和环境的影响程度较低。另外，由于互联网技术发展和进步，后期环境DNA能够充分利用无人设备、分子探针等新技术，实现分析、监测和预警自动化，从而减少对人力和分类学家的依赖。这些优势使得环境DNA成为一种无可比拟的监测方式。

5 环境DNA的未来发展方向

5.1 结合空间分析

使用环境DNA技术调查水生生物时，不仅关注物种是否存在和生物量，也重视入侵物种的区域分布和潜在入侵区域。研究表明，当结合环境DNA技术和统计模型后，能够提高监测入侵物种环境DNA的效率。某一研究就通过联系环境DNA和物种空间分布预测模型，成功检测出引入物种牛鳟的分布情况，也较好地应用在泥鳅、小口黑鲈等入侵物种的监测中。另外，遥感技术的应用也提高入侵范围和潜在入侵地研究效率。对于环境DNA而言，空间分析、统计模型的应用提高了其可探测性，也大大提高了检测结果的准确度，实现了空间预测和分析。所以，这也是环境DNA技术研究的方向和前景。

5.2 检测设备研发

环境DNA技术的发展在便携设备和快速检测方面带来了许多好处。对于环境DNA现场分析时，可以充分应用便携式qPCR 仪、纳米孔测序仪等设备，从而降低样品被污染和被降解的概率，也为环境DNA在复杂水域环境的研究提供助力。但是，我们很难在现有市场当中发现一套针对性强、准确度高的环境DNA检测装置。

在监测入侵物种方面，跨学科技术的结合为环境DNA 的快速检测提供了新思路。例如，结合光透射光谱和环境DNA技术，在印第安纳港口附近，研究人员成功检测到了斑马贻贝，高效快速地检测出压舱水和港口水域的入侵物种情况。这也提高了环境DNA的应用效果，为之提供了坚实的技术基础[12]。

随着技术的发展，环境DNA 应当重视分析方法的改进和升级，比如：制度科学的采样制度、研发高分辨率的引物序列和完善本地物种数据库等，这才能大大提高环境DNA应用效果。另外，环境DNA的应用应当充分联系新技术和新方法，通过人工智能、遥感技术和大数据等跨学科研究工具，拓宽环境DNA适用范围，提高其准确度、科学性和智能化。