AECOPD 患者诱导痰和血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75表达水平及其临床意义

马青松，赵芝焕，马丽容，李玮璟，刘 凌

（昆明医科大学第一附属医院呼吸与危重医学二科，云南 昆明 650032）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种致残率和致死率较高的慢性气道炎症性疾病。近年来通过分析各种生物标志物与相关临床参数、评分量表相关性，以期提出COPD 新的病情评估指标和治疗靶点。关于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、可溶性肿瘤坏死因子受体（soluble tumor necrosis factor receptor，sTNFR）水平在COPD 中的研究并不少见，但大都以COPD 稳定期患者为研究对象，且仅单一在血清或者诱导痰中检测TNF-α、sTNFR 水平，不同研究纳入的临床参数不同。本研究在急性加重的COPD（acute exacerbation of COPD，AECOPD）患者中同时检测诱导痰和血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平，比较治疗前后、戒烟后上述炎症介质的水平变化，探讨炎症介质与肺功能、急性生理学及慢性健康状况评分-II（acute physiology and chronic health evaluation score-II，APACHE-II 评分）的相关性，进行气道炎症与全身炎症的相关性分析，以期为AECOPD 患者提出新的疗效及病情评估生物标志物提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 病例资料

1.1.1 研究对象选择昆明医科大学第一附属医院于2019 年1 月至2020 年12 月住院的40 例AECOPD 患者入组，其中男性38 例，女性2 例，年龄57～87 岁。纳入标准：（1）符合2018 年GOLD 指南C 组和D 组诊断标准[1]：肺功能检查示吸入支气管扩张剂后第1 s 用力呼气容积比用力肺活量（forced expiratory volume in one second/forced vital capacity，FEV1/FVC）＜ 70%，过去1 a中重度急性加重史（≥ 2 或≥ 1 次导致住院）；（2）处于急性加重期[2]；（3）既往至少有20 a 以上吸烟史。排除标准：（1）合并支气管哮喘、支气管扩张、肺结核等慢性呼吸系统疾病；（2）合并严重心、肝、肾疾病，2 型糖尿病，过敏性疾病，恶性肿瘤；（3）需要机械通气，需全身激素治疗，合并肺炎，治疗1 周病情无明显缓解；（4）不能配合肺功能检查，不能顺利完成诱导痰及痰标本不合格；（5）已戒烟，但戒烟时间不足1 a 者。

1.1.2 分组分为治疗前（Ⅰ组）：入院当天，输液治疗前；治疗后（Ⅱ组）：入院治疗第8 天且临床表现有明显好转；根据目前是否戒烟（要求至少完全戒烟1 a 及以上），分为戒烟组（Ⅲ组）、吸烟组（Ⅳ组）。

1.1.3 治疗和知情同意氧疗、抗感染、平喘、抗炎、祛痰治疗。签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 诱导痰操作及采集入组患者治疗前后吸入沙丁胺醇400 µg，15 min 后再次测定肺功能，若第1 秒用力呼气容积占预计值百分比（percentage of predicted FEV1value，FEV1%pred）≥ 60%以浓度3%高渗盐水雾化，而FEV1%pred ＜ 60%以0.9%生理盐水雾化，参照文献[3-4]的方法进行诱导操作。用无菌镊子夹取痰栓于离心管中，称重（≥ 0.2 g），加入4 倍体积0.1%二硫苏糖醇（DTT）37 ℃温浴10 min，振荡摇匀，用300 目尼龙滤网过滤后，滤液于3 600 r/min 离心5 min，离心后上清液置于冻存管中-80 ℃冰箱中保存待测。

1.2.2 采血空腹外周静脉血3 mL，离心（2 500 r/min，10 min）后取上清液置于冻存管中-80 ℃冰箱中保存待测。

1.2.3 TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 的测定诱导痰上清和血清均应用江苏酶免实业有限公司人类TNF-α/TNFR 酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒，采用ELISA 法测定TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平，操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 肺功能、动脉血气分析入组患者在治疗前后均进行肺功能和动脉血气检测，包括FEV1、FEV1%pred、FEV1/FVC。

1.2.5 APACHE-II 评分收集入组患者年龄、合并症，结合治疗前和治疗后生命体征、血常规、血生化、动脉血气分析、尿量进行APACHE-II评分。

1.3 统计学处理

数据分析采用SPSS25.0 统计软件。计量资料服从正态分布采用均数±标准差（）表示；同组治疗前后比较采用配对t检验，不同组别比较用独立样本t检验。偏态分布用M（P25，P75）描述，2 组间比较采用秩和检验。相关性分析，服从正态分布采用Pearson 相关分析，不服从正态则用Spearman 相关分析。P＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AECOPD 受试者基线资料

入组 40 例 AECOPD 患者平均年龄（72.43±8.51）岁，吸烟指数（548.00±280.42）。GOLD Ⅱ级（50%～79%）14 例、Ⅲ级（30%～49%）18 例、Ⅳ级（＜ 30%）8 例。戒烟组（Ⅲ组）25 例，目前吸烟组（Ⅳ组）15 例。

与Ⅰ组相比、Ⅱ组患者PaO2、APACHE-II 评分、肺功能指标明显改善。Ⅳ组肺功能较Ⅲ组差（P＜ 0.05）；而年龄、BMI、吸烟指 数、PaO2、PaCO2、APACHE-II 评分在不同组别之间差异均无统计学意义（P＞ 0.05），见表1。

表1 各组一般情况比较（）Tab.1 The general situation of each group is compared（）

表1 各组一般情况比较（）Tab.1 The general situation of each group is compared（）

*P ＜ 0.05。

2.2 治疗后TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 的变化

治疗后血清中TNF-α 水平明显下降（t=2.348，P=0.024），sTNFR-55、sTNFR-75 水平增加（P＞ 0.05）；治疗后诱导痰中TNF-α 水平下降（t=2.191，P=0.035），而sTNFR-55（P＜ 0.05）和sTNFR-75（P＞ 0.05）水平均升高，见表2。

表2 治疗后TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平的变化[（），pg/mL]Tab.2 Changes of TNF-α，sTNFR-55 and sTNFR-75 levels after treatment [（），pg/mL]

表2 治疗后TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平的变化[（），pg/mL]Tab.2 Changes of TNF-α，sTNFR-55 and sTNFR-75 levels after treatment [（），pg/mL]

*P ＜ 0.05。

2.3 戒烟后TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平的变化

Ⅲ组诱导痰中TNF-α 水平低于Ⅳ组（Z=-2.626，P=0.008），而sTNFR-55、sTNFR-75 水平高于Ⅳ组（t=2.716，P=0.01；Z=-2.696，P=0.006）。血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75水平在2 组患者之间无明显差异（P＞ 0.05），见表3。

表3 戒烟后诱导痰和血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 的变化[/M（P25，P75）]Tab.3 The changes of TNF-α，sTNFR-55 and sTNFR-75 in sputum and serum were induced after smoking cessation[/M（P25，P75）]

表3 戒烟后诱导痰和血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 的变化[/M（P25，P75）]Tab.3 The changes of TNF-α，sTNFR-55 and sTNFR-75 in sputum and serum were induced after smoking cessation[/M（P25，P75）]

*P ＜ 0.05。

2.4 TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 与肺功能、APACHE-II 评分的相关性分析

诱导痰中，TNF-α 水平与FEV1、FEV1%pred、FEV1/FVC 呈负相关（r分别-0.827、-0.865、-0.868，P＜ 0.001），sTNFR-55 水平与FEV1、FEV1%pred、FEV1/FVC 呈正相关（rs分 别0.415、0.330、0.305，P＜ 0.05），sTNFR-75 水平与FEV1、FEV1%pred、FEV1/FVC 呈正相关（rs分 别0.903、0.969、0.965，P＜ 0.001），TNF-α 水平与APACHE-II 评分呈正相关（r=0.374，P=0.001），sTFR-55、sTNFR-75 水平与APACHE-II 评分呈负相关（r分别为-0.227、-0.341，P＜0.05）；而血清中，TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平与肺功能指标、APACHE-II 评分均不存在相关性（P＞0.05），见表4。

表4 TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平与肺功能、APACHE-II 评分的相关性分析（r/rs）Tab.4 Correlation analysis of TNF-α，sTNFR-55，sTNFR-75 levels with lung function and APACHE-II score（r/rS）

2.5 诱导痰 和血清中 TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平的相关性分析

诱导痰与血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平之间均不存在相关性（P＞ 0.05），见表5。

表5 诱导痰与血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平相关性分析Tab.5 Correlation analysis between induced sputum and serum levels of TNF-α，sTNFR-55 and sTNFR-75

3 讨论

TNF-α 是一种强大的促炎介质，在AECOPD炎症驱动中发挥重要作用[5]。sTNFR 是循环和气道中的潜在抗炎介质，可阻断炎症反应，高浓度时缓解TNF-α 诱导的炎症反应，低浓度时则可以作为炎症状态标志物[6]。COPD 患者血清、诱导痰中均检测到TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平升高[7]。

本研究结果与Zeng[8]和Vernooy 等[9]的研究相符，治疗后诱导痰和血清中促炎介质TNF-α水平下降，抗炎介质sTNFR 水平上升，气道炎症与气流受限密切相关，诱导痰TNF-α 水平越高，肺功能损伤程度越重。一项横断面研究[10]分析比较COPD 急性加重期及稳定期、健康对照者3 组受试者血清TNF-α、sTNFR 水平差异，发现COPD 患者中TNF-α、sTNFR 水平较健康对照组均有升高，其中TNF-α 表达在急性加重期组升高，在稳定期组降低；而sTNFR 表达在急性加重期组下降，在稳定期组上升。表明在COPD 不同时期均存在气道和全身促炎与抗炎介质动态变化，治疗后或疾病恢复后二者恢复平衡。不同的是，这项研究中血清TNF-α、sTNFR 水平与肺功能指标存在相关性，可能与该研究纳入的AECOPD患者肺功能更差、病情更重有关。

本研究发现APACHE-II 评分与诱导痰中TNF-α 水平呈正相关，与sTNFR-55、sTNFR-75 水平呈负相关，而与血清中3 种炎症介质水平不存在相关性，提示气道炎症能而非全身炎症能一定程度反映AECOPD 病情严重程度。

本研究结果表明诱导痰和血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平之间不存在相关性，仅诱导痰中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平与肺功能指标存在相关性，提示全身炎症的存在可能并不是由于局部炎症的溢出，气道及全身炎症反应的调控机制可能不同。Sapey 等[11]研究同样指出血清和诱导痰中的TNF-α 无直接关联，没有证据支持任何一种细胞因子直接从肺部溢出至血液中。然而，一种细胞因子可能通过自分泌及旁分泌局部释放，引起另一种细胞因子释放至血液循环中从而引起全身炎症，例如IL-6 释放引起CRP 产生[12]。近年来研究[13]指出全身炎症表型作为COPD 一个新的表型，并非所有患者均存在持续系统炎症反应，长期随访过程中炎症反应并不稳定，而且不同COPD 研究中炎症标志物种类均不同，各种气道和全身炎症介质的代谢途径尚未完全清楚。COPD 全身炎症与气道炎症之间的联系尚不清楚，并不能通过简单“溢出”原理来解释，目前并未发现能解释两个部位炎症联系的标志物及炎症通路，可能存在特定的全身炎症表型也尚不可知，有待进一步研究。

本研究结果表明戒烟后诱导痰中TNF-α 水平降低，sTNFR-55、sTNFR-75 水平升高，而血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR 水平则不存在上述改变，与Vernooy 等[9]研究结果相符，提示COPD 患者戒烟后气道炎症并未减轻。Willemse等[14]一项前瞻性研究，观察28 名COPD 吸烟者戒烟1 a 后气道炎症变化，结果发现支气管活检中气道炎症持续存在，痰液中中性粒细胞比例和IL-8 水平均增加，进一步证实COPD 患者戒烟后气道炎症仍在进行，可能与持续微生物刺激和自身免疫机制有关[15]。目前认为戒烟是COPD 预防和治疗的重要措施，既往研究[16]表明戒烟能减缓FEV1下降，改善呼吸系统症状和气道高反应性，关于戒烟对疾病影响的潜在机制尚不可知，可能与气道炎症及气道重塑过程受到影响有关。

综上，诱导痰中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平有望作为AECOPD 疗效、病情严重程度评估的炎症标志物。COPD 全身与气道炎症可能存在不同的调节机制，二者之间的联系尚不清楚，可能存在特定的全身炎症表型。戒烟后COPD 患者气道炎症仍在进展。