参连复脉颗粒对大鼠再灌注心律失常的影响及机制研究

鲁婷婷，汪吴娇，杨志飞，任建勋，林 谦，万 洁

再灌注治疗是针对心肌缺血快速有效的治疗方法，但在血管再通的同时，常导致心肌再灌注损伤，其主要的表现形式为再灌注心律失常(reperfusion arrhythmia，RA)[1]。研究表明，心肌梗死后溶栓或支架植入后，室性心律失常发生率高达80%；超过50%死亡病例的致死原因为再灌注所致心律失常[1-2]。因此，预防再灌注心律失常具有重要意义。参连复脉颗粒(专利号：ZL201310303390.5)是北京中医药大学东方医院协定处方。研究表明，参连复脉颗粒对室性心律失常具有一定的疗效[3]。而再灌注心律失常以心室颤动(VF)+室性心动过速(VT)等室性心律失常为主[1]，本研究拟在前期基础上，采用大鼠心肌再灌注损伤模型探讨参连复脉颗粒对再灌注心律失常的药效作用，并基于网络药理学进一步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠60只，无特定病原体(SPF)级，雄性，体质量200～220 g，维通利华(北京)实验动物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0004。

1.1.2 药物与试剂 参连复脉颗粒，由党参、丹参、黄连、法半夏、赤芍、川芎、鬼箭羽、白芍、 远志、酸枣仁、炙甘草组成，提取浸膏粉，每克膏粉含4.27 g生药，成人临床日用量为40.5 g，批号：Z70301，由北京中医药大学附属东方医院提供。盐酸美西律片(石药集团欧意药业有限公司生产，批号：377131203，规格：每片50 mg)，0.9%氯化钠注射液(北京双鹤药业股份有限公司生产，批号：C201202095)。

1.1.3 实验仪器 ALC-V8型小动物呼吸机(上海奥尔科特生物技术有限公司)，心电图解析系统(Softron SP-2006，北京软隆生物技术有限公司生产)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、美西律组、参连复脉颗粒低高剂量组、参连复脉颗粒中剂量组、参连复脉颗粒高剂量组，每组10只。假手术组：左冠状动脉前降支穿线不结扎，灌胃生理盐水3 mL/kg；模型组：灌胃生理盐水3 mL/kg；美西律组：灌胃盐酸美西律60 mg/kg；参连复脉颗粒低、中、高剂量组：分别灌胃参连复脉颗粒2.0 g生药/kg、4.0 g生药/kg、8.0 g生药/kg。各组采用的干预药物均以生理盐水配至所需浓度，经灌胃口服给药1次，给药量为100 g体质量1 mL。

1.2.2 造模方法 各组大鼠予相应的药物或生理盐水灌胃30 min后，使用50 mg/kg剂量的戊巴比妥钠腹腔麻醉，连接心电图解析系统记录标准Ⅱ导联心电图，切开气管，插入气管插管，连接呼吸机，开胸，暴露心脏，于冠状动脉左前降支根部穿线，以备结扎；穿线后稳定10 min，结扎(无ST段及T波改变者淘汰)，15 min后，剪断结扎线，使前降支实现再灌注。再灌注后，动物在1 min内即出现室性期前收缩(PVC)、VT及VF等不同程度的心律失常。观察再灌注后10 min内PVC个数和VT+VF总时程。

1.3 网络药理学分析

1.3.1 参连复脉颗粒的组成及靶点预测 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)获得参连复脉颗粒各味药的成分信息，筛选条件为经口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18。同时预测成分的靶点。TCMSP数据库中搜索不到的中药，用BATMAN-TCM[4](http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/) 检索，默认设置，筛选有效成分及相应潜在靶点。

1.3.2 再灌注心律失常疾病靶点 应用OMIM数据库(https：//omim.org/)和GeneCards(www.genecards.org)，以reperfusion arrhythmia为关键词，删除重复值，两个数据库取并集作为再灌注心律失常疾病靶点[5-6]。与上述参连复脉颗粒靶点取交集，得到参连复脉颗粒治疗再灌注心律失常的作用靶点。

1.3.3 Venn图绘制 应用微生信在线平台(http：//www.bioinformatics.com.cn/)将各单味药及再灌注心律失常相关靶点导入，绘制Venn图，找到多个单味药共同作用的靶点。

1.3.4 京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析 应用Metascape(http：//metascape.org/)平台，将参连复脉颗粒治疗再灌注心律失常靶点导入，行KEGG富集分析，并对结果进行可视化处理[7]。

1.3.5 关键节点选择 将参连复脉颗粒潜在靶点和再灌注心律失常疾病交集靶点，上传至STRING数据(https：//www.string-db.org/)构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，把最低相互作用阈值设为中等置信度(medium confidence=0.4)，其余参数保持默认设置，将PPI网络生成文件导入Cytoscape 3.7.1，利用插件CytoCNA，将网络节点的介度(betweenness，BC)、紧密度(closeness，CC)均大于中位值，连接度(degree，DC)大于2倍中位值的靶点作为核心靶点。

2 结 果

2.1 参连复脉颗粒对PVC总个数及VT+VF总时程的影响 与模型组比较，参连复脉颗粒中、高剂量组及美西律组PVC总个数和VT+VF总时程均明显下降(P<0.05或P<0.01)；参连复脉颗粒高、中、低剂量组VT+VF总时程高于美西律组(P<0.05或P<0.01)，而参连复脉颗粒高、中剂量组PVC总个数与美西律组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组PVC总个数及VT+VF总时程比较(±s)

2.2 网络药理学预测结果

2.2.1 靶点预测 应用TCMSP数据库检索参连复脉颗粒各味药成分信息，预测靶点见表2，用UniProt(https：//www.uniprot.org/)数据库，对靶点基因名进行规范化处理。其中，远志、鬼箭羽通过BATMAN-TCM数据库检索。最后得到药物潜在靶点314个。在GeneCards中检索到再灌注心律失常靶点993个，OMIM 中131个。去重后将2个数据库再灌注心律失常靶点取并集得到疾病靶点1 076个。将药物靶点与疾病靶点取交集，得到参连复脉颗粒治疗再灌注心律失常潜在靶点136个，并对结果进行可视化，详见图1。以作用于交集靶点排名前五种活性成分作为核心成分(共有成分以“S加数字”进行编号)，详见表3。

表2 参连复脉颗粒中各中药活性成分种数与对应靶点数 单位：个

图1 参连复脉颗粒和再灌注心律失常交集靶点Venn图

表3 主要核心活性成分及其作用靶点

2.2.2 靶点筛选 在STRING数据平台输入136个交集靶点进行拓扑分析，得到一个由136个节点和2 339条边组成的网络(见图2A)。首先，以DC、BC和CC大于中位数进行筛选，得到53个节点和1 090条边的网络图(见图2B)； 然后，以DC大于中位数的2倍进一步筛选，最终构建一个26个节点和318条边的参连复脉颗粒作用于再灌注心律失常核心靶点网络图(见图2C)。用节点的大小表示 DC的大小，26 个关键靶点依次为蛋白激酶B1(AKT1)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素6(IL6)、白介素1β(IL1β)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、JUN、环加氧酶2(PTGS2)、表皮生长因子受体(EGFR)、一氧化氮合酶3(NOS3)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、信号传导蛋白和转录激活物3(STAT3)、CC趋化因子配体2(CCL2)、白介素10(IL10)、CXC趋化因子配体8(CXCL8)、 缺氧诱导因子-1α(HIF1A)、细胞间黏附分子1(ICAM1)、Myc原癌基因蛋白(MYC)、雌激素受体1(ESR1)、FOS、热休克蛋白90 AA1(HSP90AA1)、核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂α(NFKBIA)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、血红素加氧酶1(HMOX1)。

图2 共同靶点 PPI 网络图

2.2.3 靶点分析 KEGG富集分析结果见图3。提示参连复脉颗粒通过调节细胞分化、炎症反应等相关蛋白和信号通路发挥作用。参连复脉颗粒主要通过干预凋亡信号通路(apoptosis)、TNF信号通路 (TNF signaling pathway) 、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路 (PI3K-Akt signaling pathway) 等多个信号通路发挥治疗作用。而TNF信号通路和PI3K-AKT信号通路是凋亡通路的重要组成部分，NF-κB信号通路是TNF信号通路的重要组成部分。再次说明了该复方治疗再灌注心律失常的作用机制。凋亡信号通路图见图4(红色的基因或蛋白是参连复脉颗粒治疗再灌注心律失常的作用靶点)，再次印证了参连复脉颗粒作用于多种靶蛋白，启动并调控复杂的信号转导，抑制心肌细胞凋亡，改善心肌再灌注病人预后，降低再灌注心律失常发生率。

图3 KEGG通路富集分析

图4 凋亡通路

3 讨 论

中医对再灌注心律失常无系统论述，现代医家多将其归属“胸痹”“心悸”范畴[8]。再灌注治疗相当于中医“破血逐瘀”法，此过程耗气伤血；气虚则进一步加重血瘀，故气虚血瘀贯穿病人治疗前后，而出现再灌注心律失常。相关研究也表明，气虚血瘀为再灌注心律失常的核心病机[9]。针对VT与VF等快速性心律失常临床以阴虚痰热与痰热扰心证为多见[10]，故再灌注损伤所导致的再灌注心律失常，常在气虚血瘀基础上，合并阴虚痰热或痰热扰心证。常用的中成药参松养心胶囊与稳心颗粒对于快速性心律失常证属气阴两虚、瘀血阻络者具有良好疗效，而对于气虚血瘀合并痰热扰心证的快速性心律失常尚缺乏疗效可靠的上市中成药。针对证属气虚血瘀兼痰热扰心型心悸的治疗，林谦教授依据气血理论并结合自身临证经验拟定了参连复脉颗粒，补充了当前临床对心律失常气虚血瘀兼见痰热扰心证的治疗空白。

本研究采用冠状动脉左前降支线栓结扎法制作大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，发现参连复脉颗粒能明显减少再灌注心律失常的发生。进一步通过网络药理学的方法分析了其药效机制，KEGG通路分析发现，参连复脉颗粒参与调控的通路主要有凋亡、PI3K-AKT和TNF等信号通路。再灌注心律失常是心肌缺血再灌注损伤的主要表现形式，也是致死性心肌再灌注损伤的潜在标志[11]。而心肌细胞凋亡是再灌注损伤发生机制的一个重要早期病理生理表现，也是再灌注损伤发生的上游机制之一。通过抑制心肌细胞凋亡等上游机制从而预防心肌再灌注损伤和再灌注心律失常的发生是近年心肌缺血再灌注研究的热点[12-14]。凋亡通路中的促凋亡蛋白Bax是凋亡蛋白Bcl-2基因家族的成员，与Bcl-2形成异源二聚体，发挥促凋亡因子的作用，Caspase-3在心肌细胞凋亡过程中，是最关键的蛋白酶之一，也是凋亡参与执行者[15]。研究发现，心肌再灌注损伤时，Bax/Bcl-2和Caspase-3的表达均明显升高，上调抗凋亡蛋白Bcl-x和Bcl-2对心肌有保护作用[15-16]。PI3K-AKT信号通路是凋亡通路中的一条重要通路，通过促进Bcl-2、磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化AKT(p-AKT)表达，抑制Caspase-3和Bax表达被激活，从而减少心肌细胞凋亡、炎性因子的产生和缩小心肌梗死面积，进而缓解心肌再灌注损伤[17]。通过激活PI3K/AKT通路靶向抑制下丘脑室旁核交感神经活动可能是治疗再灌注心律失常的一种潜在方法[18]。TNF通路是凋亡通路的另一条重要通路，NF-κB信号通路存在TNF通路中，是TNF与TNF-R1的相互作用激活的一种信号转导途径之一。在缺血再灌注损伤时，该通路被迅速激活，进一步激活下游TNF-α、IL-6等炎性因子，从而促进心肌细胞凋亡，心肌梗死面积增大、心功能受损以及室性心律失常的易感性，抑制该通路可保护再灌注损伤，降低再灌注心律失常的易感性[19]。

经过筛选，发现参连复脉颗粒作用于再灌注心律失常的主要成分为槲皮素、山奈酚、木犀草素和丹参酮ⅡA等。其中槲皮素预处理一方面能降低TNF-α、C反应蛋白(CRP)和白介素-1β(IL-1β)等细胞因子，从而抑制炎症级联反应。另一方面，能降低Bax水平和提高Bcl-2水平，抑制细胞凋亡；从而提高AKT的磷酸化水平，激活PI3K/AKT通路参与抗凋亡等途径对心肌缺血再灌注损伤产生保护效用[20]。木犀草素可激活PI3K/AKT通路，增加Bcl-2 相关死亡促进因子(BAD)磷酸化，降低Bax与Bcl-2比值，降低心肌细胞凋亡率[21]。山奈酚可降低IL-6、TNF-α和NF-κB水平。激活细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)，抑制活性c-JNK和p38蛋白，降低促凋亡蛋白(Caspase-3和Bax)水平[22]。丹参酮ⅡA能够激活PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路进而缓解大鼠心肌缺血再灌注损伤[23]。课题组前期通过高效液相色谱法同时测定该方中君药丹参中丹酚酸B、丹参酮ⅡA和臣药白芍、佐药赤芍中的有效成分芍药苷3种活性成分的含量，作为该方的质量控制标准提取浸膏粉，再通过一定工艺制备成参连复脉颗粒[24]。进一步印证了本方君药丹参的主要成分丹参酮ⅡA是本方的主要成分之一。STRING筛选结果显示，根据DC值排名前10的核心基因分别为AKT1、TNF、IL6、IL1β、MMP9、TP53、MAPK3、CASP3、JUN、PTGS2，基本包含以上成分调控的基因，进一步印证了参连复脉颗粒可能主要通过槲皮素、山奈酚、木犀草素和丹参酮ⅡA等成分，作用于AKT1、TNF、IL6、IL1β、MMP9、TP53、MAPK3、CASP3、JUN、PTGS2等核心基因，从而调控凋亡信号通路、PI3K/AKT信号通路以及NF-κB等信号通路，抑制再灌注后心肌凋亡和炎症反应，从而对心肌再灌注损伤产生保护作用，降低再灌注心律失常的发生率。

综上所述，参连复脉颗粒可通过多途径、多靶点预防再灌注心律失常，其中一些靶点前期研究已进行了相关实验，如参连复脉颗粒可改善TNF-α、IL-6介导的炎症反应，进而对心房颤动易感性起到抑制作用[25]。本实验基于参连复脉颗粒在体的药理作用，利用网络药理学全面分析了其预防再灌注心律失常的机制，为后续探究参连复脉颗粒的作用机制提供思路和方向。但参连复脉颗粒是否通过上述通路发挥作用以及主要作用靶点之间、主要通路间和主要靶点与通路间相互作用情况仍需进一步实验验证，另外由于参连复脉颗粒药味较多，本研究虽然使用的是目前常用的检索工具，但在预测靶点上仍存在一定的局限性，故其确切机制需进一步探讨。