Toll样受体4信号通路在糖尿病视网膜病变中的研究进展

李晓洁，许泽鹏，黄玉婷，郑香悦，俞晓艺

糖尿病视网膜病变（diabetes retinopathy，DR）是由糖尿病（diabetes mellitus，DM）引起的最严重和最常见的微血管并发症之一，也是导致工作年龄人群视力下降的主要原因。据统计[1]，目前全球DR患者近9,500万人，致盲人群中有近1/3是由DR 引起，我国目前DR 在DM 患者中的患病率为30.1%[2]。因此，随着近年来DM 患者数量剧增，积极探寻DR发病机制及药物治疗研究尤为重要。研究[3]表明，多元醇通路异常、氧化应激、晚期糖基化终末产物增多、蛋白激酶C激活及炎症反应等多种发病机制均参与到DR 发病。Toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）是一种模式识别受体，分布极其广泛，可以识别外来的致病微生物，调节免疫应答，通过激活细胞内信号转导通路的方式，产生炎症反应。本文旨在对TLR4信号通路在DR发病机制中的作用进行综述。

1 TLR4信号通路

1.1 TLR4结构

Toll 样受体家族（toll-like receptor，TLR）是自然免疫中的I 型跨膜糖蛋白受体，是特异性免疫和非特异性免疫之间的重要中介。其最早是在果蝇胚胎发育过程中发现，可在果蝇及哺乳动物中广泛表达[4]。

TLR4 是第一个在哺乳动物身上发现的TLR，分布广泛，几乎囊括所有细胞系[5]。TLR4 主要识别外源性配体脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），TLR4 可以发生突变或敲除，使动物对LPS 无反应。TLR4 还可识别某些内源性配体，如游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，OX-LDL）、热休克蛋白、高速泳动族B1 蛋白（high speed swimming group B1 protein，HMGB1）等，这些内源性配体大部分是在应激和细胞损伤中产生的。TLR4 与其配体结合，经信号转导可激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），分泌释放白细胞介素（interleukin，IL）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等细胞因子，这些细胞因子在炎性反应中发挥重要作用[6]。

1.2 TLR4的信号传导

目前研究[7]表明，TLR4 主要能激活2 种下游信号传导途径，一条是髓样分化蛋白88（myeloid differentiation protein，MyD88）依赖性信号通路，另一条是MyD88 非依赖性信号通路。

1.2.1 MyD88 依赖性信号通路 MyD88 依赖性信号通路主要是通过NF-κB 和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路发挥作用。在细胞外，LPS和TLR4 结合，使得信号传导至细胞内，MyD88 被激活，IL-1 受体相关激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）磷酸化，与肿瘤坏死因子受体活化因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factors，TRAF-6）相互作用形成IRAK-TRAF6复合物。TRAF6激活NF-κB抑制物激酶（inhibitor of NF-κB kinase，IKK）复合物和转化生长因子β活化激酶1（transforming growth factor-β activated kinase-1，TAK1），传导下游的信号通路，最终调控多种细胞因子表达，在细胞增殖、分化、死亡、炎症等病理过程中发挥作用[8]。

1.2.2 MyD88 非依赖性信号通路 MyD88 非依赖性信号通路主要导致干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）和NF-κB 的延迟激活。β 干扰素TIR 结构域衔接蛋白（TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）被TRIF相关衔接分子（TRIF-related adaptor molecule，TRAM）间接招募，结合TRAF6，一方面激活下游IRF3，使其释放干扰素γ诱导蛋白10、TNF-α、IL-1等细胞因子，另一方面TRAF6使IKK激活，NF-κB活化释放至细胞核内，进而调控炎症因子表达[9-10]。

2 TLR4通路与DM

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）为多种代谢异常的慢性病症，其2 大重要病理生理机制是胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和胰岛β 细胞分泌不足，而局部组织炎症是贯穿这两者的病理特征及中心环节。越来越多的研究[10-13]证实，TLR4 通路可以参与T2DM 及其并发症的发生发展。

人体内胰岛β 细胞分泌胰岛素，外周组织胰岛素缺陷和敏感性降低导致血糖升高，DM 患者的代谢紊乱引发低度慢性炎症，进而导致胰腺逐渐丧失胰岛β 细胞[14]。TLR4 通路通过调节免疫应答来激活下游炎性信号通路途径，引起IL-1、IL-6、TNF-α 等细胞因子转录。CUCAK H 等[15]研究发现胰岛的巨噬细胞中存在大量TLR4 活化，这与细胞因子产生和β 细胞凋亡有密切联系。WANG X 等[16]发现小鼠TLR4 通路的激活以及随后产生的IL-1β 和TNF-α 参与了急性静脉高血糖负荷的胰岛β细胞功能障碍的发生。

TLR4 通路可诱导胰岛素受体底物自身磷酸化，并干扰胰岛素信号级联反应，阻滞底物与胰岛素受体结合，最终引发IR[17]。在其TLR4 的信号转导中，LPS 作为其主要外源性配体，发挥至关重要的作用。GOMES J 等[18]进行系统评价发现，LPS 与IR 密切相关，T2DM 代谢异常导致LPS 吸收增加，血浆LPS 浓度升高。LPS 结合TLR4 激活下游信号途径后，多种促炎介质的分泌，包括众所周知能促进IR 的TNF-α 和IL-6，引起的内毒素血症与肥胖引起的炎症纠缠在一起[19]。除此之外，TLR4 信号通路对胰岛素信号转导发挥效应还可以通过参与下丘脑炎症反应实现[20]。随着科技不断发展，TLR4信号通路可能成为治疗及预防DM的一个新靶点。

3 TLR4通路与DR

现代医学研究[21]发现，DM 患者在引起视网膜损伤之前，就已经有了一系列的病理生理改变来破坏视功能，而这些改变可能跟氧化应激、炎性因子释放、VEGF 产生、糖基化终末产物、表观遗传学、基因多态性等多方面有关。TLR4作为免疫蛋白家族成员之一，在各个方面都提示着其与DR 之间存在着密不可分的关系。

3.1 氧化应激

氧化应激是由于活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的形成与清除失衡导致的。在高糖环境下，过量的代谢副产物可通过激活多元醇、氨基己糖、蛋白激酶C 和血管紧张素Ⅱ等多条途径[22-23]，导致ROS 过量生成。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是生成ROS 的主要酶，过多的葡萄糖使NADPH 再生，细胞内抗氧化剂谷胱甘肽（glutathione，GSH）减少，ROS蓄积过量，进而破坏细胞膜和重要的生物分子，如DNA、蛋白质等，导致细胞坏死。氧化应激在DR 发病机制中处于基础地位，通过抑制DM 患者过强的氧化应激延缓DR的发展，已得到许多研究[24]的支持。

而TLR4 也在DR 氧化应激中扮演着重要的角色。研究[25]证实，TLR4 基因突变小鼠虽然无法阻断高剂量链脲佐菌素后的高血糖，但延缓了疾病的进展，并改变了缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α）在内的多种氧化应激因子水平。MyD88 是所有TLR 的共同信号分子，可介导NF-κB 的下游激活。高血糖激活TLR4 的表达，依赖于MyD88 以及非MyD88 介导的信号传递通路，激活NF-κB 活性，这种效应可能是通过蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活NADPH 氧化酶来介导的[26]。ALOMAR SY 等[27]研究结果表明，二甲双胍作为辅助治疗阻碍DR 发展，部分是通过抑制氧化应激诱导的TLR4/NF-κB 通路和抑制谷氨酸兴奋性毒性来实现的。

血管内皮细胞是氧化应激的早期靶标，而TLR4 与晚期内皮祖细胞的功能活性有关，TLR4高表达可降低其存活率、迁移能力、黏附能力和体外血管生成能力[28]；高糖环境下培养的人视网膜内皮细胞TLR4表达上调，通过激活TLR4/NFκB 信号通路，诱导内皮细胞坏死[29]。最新的研究[30-31]表示，内皮细胞中TLR4 的缺失对DM 诱导的损伤具有保护作用，牛蒡子苷可通过下调TLR4蛋白表达来抑制高糖诱导的神经节细胞凋亡和氧化损伤。此外，氧化应激还参与视网膜神经节细胞的损伤，视网膜神经节细胞在高糖环境下，TLR4/NFκB 信号通路被激活，通过抑制TLR4可有效减少神经节细胞坏死[7,32]。

OX-LDL 是TLR4 内源性配体之一。有学者[33]利用多因素Logistic 回归分析证实，OX-LDL 与DR 的存在显著相关。血管内皮细胞受到ROS 刺激后，存在于血管内皮下的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）氧化生成OX-LDL，而OX-LDL 通过线粒体电子传递链等途径又可以进一步诱导细胞产生ROS，引发线粒体功能受损，诱导细胞凋亡的发生，形成恶性循环[34]。因此，TLR4通路参与DR 的发生过程可能也与OX-LDL/ROS这一途径相关。

3.2 炎性因子释放

高血糖介导的炎症反应是DR 的核心。在DR 病程当中，视网膜血管内皮细胞凋亡，血管通透性增加，血-视网膜屏障破坏及微血栓形成都跟炎症产生有关。NF-κB 作为细胞内重要的炎性核转录因子，能够调控多种细胞因子在DR中表达[35]，如IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF、血管黏附因子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、巨噬细胞炎性蛋白2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）等。

TLR4 是NF-κB 上游的经典传导因子之一，在炎症病理机制中发挥着一定的作用，TLR4/NF-κB 通路和DR 之间的迷雾也渐渐被诸多学者揭开。CHEN H等[26]进行体外试验找到了这两者之间相关性的直接证据，高糖能够诱导视网膜内皮细胞中TLR4 活化，随之而来的NF-κB 激活，IL-1、IL-8、TNF-α这些炎性因子水平也相继释放，视网膜内皮细胞发生损伤及功能的异常，最终导致DR 发生。相关动物实验研究[29,36-39]也表明，在DM大鼠的视网膜中，TLR4及炎性因子水平均升高，能够使得视网膜中的白细胞及血管渗漏量增加，继而发生血管内皮损伤、视网膜屏障破坏及新生血管（neovascularization，NV）形成等一系列DR 病理改变，而TLR4的敲除可改善DR，同时使视网膜组织厚度增加[40]。

无论体内还是体外实验，都带来了极大的启示，TLR4作为众多信号通路中的上游级联分子，可能通过炎性因子的释放最终直接及间接地参与到DR 的发病之中。有文献[7,36]报道，利用TLR4 特异性拮抗剂或沉默相关基因可以诱导NFκB 通路失活，抑制细胞的炎症、凋亡，这充分提示TLR4抑制将成为DR 治疗过程当中一个新的治疗靶点。随着研究的进一步开展，许多学者开始运用一些含有抗炎分子的提取物做了相关的研究，这些抗炎物质可以有效地抑制DM 大鼠视网膜TLR4/NF-κB通路活性，改善DR[41-44]。虽然抑制NF-κB介导的炎症通路可以减少DR 相关的炎症因子表达，但NFκB也受到多种上游信号因子的影响，因此TLR4/NF-κB通路在DR中的作用机制还有待进一步研究。

3.3 VEGF

VEGF 是一种具有高特异性的血管生成素，过度分泌可以引起视网膜渗出、出血及水肿，促进内皮细胞增殖及血管渗漏，造成严重视力损害。而DM 患者长期代谢紊乱使视网膜缺血缺氧，无疑地使周细胞、胶质细胞、色素上皮细胞等细胞过度分泌VEGF。血管生成是DR 发展的一个重要参数，提示早期病变向晚期进展，抗VEGF 药物治疗可以抑制NV再生，减轻血管渗漏，近年来，已广泛应用到DR治疗当中。

缺血缺氧是DR 病理改变的主要诱发因素之一。徐文芹等[45]发现，氧诱导视网膜病变（oxygen-induced retinopathy，OIR）小鼠模型中，TLR4在视网膜大小胶质细胞内均有表达，小胶质细胞本身能够分泌VEGF 及一些炎性相关因子，当腹腔内注射TLR4 激动剂LPS 后，视网膜NV 显著增加，这些细胞因子水平也得到提升。CHEN W 等[46]也做了类似研究，玻璃体腔注射TLR4 特异性拮抗剂TAK-242 可明显缩小OIR小鼠视网膜的无灌注区面积。因此，视网膜在缺血缺氧状态下，血管通透性增加，血管渗漏，这可能跟TLR4/VEGF 途径激活有关，而TLR4 拮抗剂的使用可能会成为一种潜在的治疗DR的新思路。

HMGB1 是一种由免疫细胞分泌的核蛋白，是参与视网膜损伤的关键介质，在DR 发展中扮演着多重角色，不仅能促炎，近年来还被证明具有促血管生成的作用[47-48]。在缺氧状态下，视网膜色素上皮细胞释放HGMB1，而作为一种自分泌或旁分泌因子，通过与其他促血管生长因子的过量产生，最终导致DR 发病过程中的血管生成、纤维化改变和结构破坏[49-50]。不仅如此，在最新的一项研究中，GU C 等[51]通过生物信息学分析构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，确定早期DR 形成NV 相关的枢纽基因，其中就包括TLR4。以上研究提示，TLR4 信号通路能在血管生成中发挥效应，与调控VEGF 表达密不可分。猜测可能存在更多与HGMB1性质类似的危险因子作用到TLR4，且靶向调控TLR4 信号通路有可能抑制血管内皮损害及NV 生成，延缓DR发生发展。

3.4 糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）

AGEs 受体（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）是免疫球蛋白家族中的一种跨膜受体，因其主要的激动剂AGEs 在长期暴露于高血糖后形成高级糖化产物而得名[52]。AGEs/RAGE 与大多数DR 的并发症有关，包括ROS、通透性变化、血管损伤和血管生成变化[53-55]。体外实验[56]中发现，RAGE 定位于视网膜胶质细胞、Müller 细胞；高糖状态下，HMGB1会与TLR4和RAGE结合[57-58]，通过NF-κB导致炎症加重。对增殖性视网膜病变的DM患者的研究[59]表明，疾病的严重程度与HMGB1水平的增加有显著的联系，这可能与HMGB1 介导了DM 诱导的视网膜周围细胞[60]和Müller 细胞[61]、视网膜神经节细胞和色素上皮细胞[62]的损伤有关。

1项研究[63]表明，增殖期DR的纤维血管组织中巨噬细胞表达AGEs、TRL4 和IL-1β，IL-1β 通过AGEs 刺激的TRL4 信号活化，诱导单核细胞来源的巨噬细胞和小胶质细胞表达半乳糖凝集素-1（galectin-3,Gal-1）。在链脲佐菌素诱导的DM中使用RAGE 融合蛋白，证实了抑制RAGE 可以防止早期DR 常见的毛细血管退化、视网膜蛋白的硝化和触觉过敏症[64]。另1 项研究[65]表明，A 类清道夫受体（class A scavenger receptor，SR-A）之所以能拮抗RAGE 的作用，主要是因为SR-A 与HMGB1/TLR4/RAGE 信号通路中的主要激酶—MAPK7 相互作用并抑制其磷酸化，从而抑制TLR4 活化，导致促炎细胞因子的分泌减少，缓解DM 视网膜炎症反应。可见，TLR4 可能是DR 的潜在治疗靶点，通过抑制HMGB1/TLR4/RAGE通路可能对DR起到一定的治疗作用。

3.5 表观遗传学

表观遗传学是指在基因核苷酸序列不变的情况下，基因表达可以发生可遗传性的变化。近年来，表观遗传修饰的机制与DR 之间的联系日益成为新兴的1 个研究领域，目前研究较多的包括DNA 甲基化，组蛋白乙酰化以及非编码RNA干扰等[66]。

基因启动子持续高甲基化状态会抑制转录因子与DNA结合，导致该基因沉默，基因转录活性受到抑制。LIU X等[67]研究表明，随着DR 病情进展，甲基化水平呈现上升趋势，叶酸通过调节DNA 甲基化和羟甲基化代谢对DR 视网膜微血管起到缓解作用，这表明外周血液中的DNA 甲基化可以作为DR 疾病进展中的预测性指标。TLR4 与DNA 甲基化之间的关系鲜有人研究，DR 领域更是未见一例。徐慧超等[68]证实，在非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型当中，可以通过调控TLR4 甲基化水平从而下调TLR4 mRNA 表达，抑制炎症发展。炎症形成也是DR重要病理过程之一，DR模型中会不会有相同的结果还有待该领域的进一步研究证实。

沉默信息调节因子1（silence information regulation factor 1,SIRT1）是一种NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶，可以参与调节细胞增殖凋亡、炎症反应、氧化应激等机体生理病理过程。MISHRA M 等[69]研究发现，可以通过SIRT1 过表达从而抑制视网膜血管内氧化应激，防止线粒体损伤，延缓DR 发展。近期亦有学者[42,70]将研究焦点扩展到免疫相关蛋白上，证实SIRT1是高糖状态下视网膜血管内皮细胞中TLR4通路调节剂，SIRT1 可以直接靶向作用于TLR4 通路，调控ROS 水平，保护细胞免受氧化应激损伤。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）也在DR 表观遗传机制中充当重要角色，其可以通过调控下游靶基因（如常见的NF-κB、VEGF 等）的表达来参与DR 发病。目前现代医学研究中与DR 相关的miRNA 数量不断增多，但尚未有文献证实，这些miRNA 是通过靶向作用于TLR4 通路在DR 中发挥调控作用。但在其他医学领域研究颇丰，例如动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）。AS 属于大血管病变，与DR同为DM 并发症，两者的发生发展都受到DM 这一“共同土壤”的滋养，在发病机制方面存在着不少共性[71]。在AS 模型中，相继有研究[72-74]显示，miR-182、miR-204、miR-135可以通过靶向TLR4 抑制OX-LDL 引发的氧化应激和凋亡，改善AS，而已有研究[75]证实，上述miRNA 与DR 有密切联系。

表观遗传修饰、视网膜线粒体稳态及氧化应激三者相辅相成、相互影响，虽然其在TLR4 通路及DR 中的作用机制仍处于早期钻研阶段，但目前现代医学已有的研究，将为表观遗传修饰靶向途径诊治和预防DR提供更多的方向。

3.6 基因多态性

基因多态性是指在1 个生物群体中，同时存在2 种或2 种以上不连续的变异型或等位基因，发生区域一般在基因序列中不编码蛋白或没有重要调节功能的区域。生物群体基因多态性现象十分普遍，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是最为常见的基因多态性，是指单个碱基通过缺失、插入或替换1 个单核苷酸而发生突变产生的多态性，其中最少1 种等位基因在群体中出现的频率不小于1%。随着技术手段的进步，遗传因素在DR的发生及进程中的重要作用也逐渐为人们所认识，多种与DR 相关的易感基因逐渐被证实[76-77]。

TLR4基因位于第9号染色体的q32～q33片段上。大量研究[78-79]发现，多种疾病的易患性以及预后，与TLR4 基因多态性呈一定的相关性。在1 项研究[80]通过多因素Logistic 回归分析显示，TLR4 基因Asp299Gly 的G 等位基因是早发DR的独立危险因素。TLR-4 基因Asp299Gly、Thr399Ile 变异的次要等位基因的存在是T2DM 的保护因素，能延缓高血糖对微小血管的持续性炎症损伤[81]。Asp299Gly 可能与DR 易感性有关，而与DM 无关[82]。猜测TLR4 基因Asp299Gly 的G 等位基因可能是视网膜病变风险增加的预测因子，并通过激活相关炎性通路参与DR的发生发展。

4 小结

TLR4 信号通路在DR 的发生和发展过程中扮演中重要角色，且通过对其调控可有效控制炎症，抑制NV 产生。已有众多学者在动物模型中通过靶向调控TLR4通路进行治疗性研究，但目前所揭示的仍然是TLR4 信号通路在DR 发病机制中的冰山一角。相信进一步研究TLR4 信号通路在DR中的作用及原理，可以为DR 的防治、新药开发及其他医学领域的科学研究带来新的思路和突破。