高效液相色谱-串联质谱法同时测定蜜饯中8 种甜味剂

杨玉娟，冯彦勇，龙玉平，周 强，潘 平，宋 佳

（1.湖南中益食品化工检测院，湖南益阳 413000；2.湖南口味王集团有限责任公司，湖南益阳 413000）

随着甜味剂的不断更新换代，甜味剂联合使用的情况越来越多，有报道称有45.61%的食品使用2种及以上的甜味剂，各甜味剂之间可能产生相互作用形成一定的潜在风险[1]。蜜饯产品为了能更好地满足消费者的甜感，会在蜜饯中加入各种甜味剂。近年来研究发现长期大量摄入人造甜味剂可能会导致高血糖，葡萄糖耐受不良、肥胖等代谢系统病，以及易怒、抑郁、记忆衰退、阿尔兹海默症等神经系统异常，甚至具有遗传毒性和致癌性[2]。目前，甜味剂检测的方法多为液相色谱法、气相色谱法和液质联用法[3-6]。液相色谱法分离效果不理想，质谱法最多同时检测6 种甜味剂[2]。本文采用高效液相色谱-质谱法同时检测8 种甜味剂，希望为蜜饯中多种甜味剂的同时检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜜饯，商场购买的散装蜜饯；甲醇，色谱纯，默克；甲酸，HPLC；亚铁氰化钾，分析纯；乙酸锌，分析纯；甜蜜素标准品，Dr. Ehrenstorfer；糖精钠标准品，Dr.Ehrenstorfer；三氯蔗糖标准品，坛墨；纽甜标准品，坛墨；AK糖标准品，Dr.Ehrenstorfer；阿斯巴甜标准品，坛墨；甜菊糖苷标准品，坛墨；爱德万甜标准品，安谱。

1.2 仪器与设备

液质联用仪AB3500，Sciex TRIPLE QUAD TM 3 500；Ax224ZH 电子天平，奥豪斯；KQ3 200 超声仪；雷磁HY-1 涡旋仪；色谱柱：SHZMADZU C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）。

1.3 试剂配制

10%亚铁氰化钾溶液：称取10 g 亚铁氰化钾溶解于100 mL 水中。20%乙酸锌溶液：称取20 g乙酸锌加3 mL 乙酸和适量的水溶解，用水定容至 100 mL。0.1%甲酸溶液：取l mL 甲酸，用水稀释并定容至1 000 mL。标准贮备液：准确称取适量的8 种甜味剂标准物质，用甲醇-水（1+1，体积比）分别配制成质量浓度为1.0 mg·mL-1的标准储备溶液， -18 ℃下避光保存，可稳定12 个月以上。

1.4 实验方法

1.4.1 样品处理

称取2 ～3 g 试样于50 mL 塑料离心管中，加入45 mL 0.1%甲酸水溶液，涡旋混匀3 min，超声 30 min，加入1 mL 10% 亚铁氰化钾和1 mL 20%乙酸锌溶液，涡旋混匀2 min，7 500 r·min-1离心 5 min，取上清液过0.45 μm 有机滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

1.4.2 标准曲线配制

精密称取爱德万甜、阿斯巴甜、纽甜、甜菊糖苷、AK 糖、甜蜜素、糖精钠和三氯蔗糖标准物质适量，置于10 mL 容量瓶中，以50%甲醇溶解定容，作为各标准物质母液；再分别吸取适量各标准物质母液至10 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀释定容混合均匀，使爱德万甜、阿斯巴甜、纽甜、甜菊糖苷、AK 糖标准物质溶液浓度约为20 μg·mL-1，糖精钠、三氯蔗糖标准物质溶液浓度约为100 μg·mL-1，甜蜜素标准物质浓度约为400 μg·mL-1，其作为标准物质混合溶液母液；进一步分别精密量取标准物质混合溶液母液不同体积至10 mL 容量瓶中，以0.1%甲酸水溶液溶解，定容，混合均匀，配制成系列浓度标准物质混合溶液，过0.22 μm 滤膜。标准物质曲线工作溶液浓度见表1。

表1 标准物质曲线工作溶液浓度

1.4.3 色谱条件

（1）液相色谱条件。色谱柱：SHIMADZU C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）；梯度洗脱：0 ～0.5 min，甲 醇10%，0.5 ～2.0 min， 甲 醇10%→90%，2 ～ 7 min 甲醇90%，7.1 ～9.0 min，甲醇90%→10%；流速：0.3 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描、正离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：4 500 V；喷雾气压力（GS1）：50 psi；气帘气压力：8 psi；辅助加热气（GS2）：35 psi；离子源温度：500 ℃；碰撞气：8 psi；定性离子对、定量离子对和碰撞气能量见表2[3]。

表2 定性离子对、定量离子对和碰撞气能量

2 结果与分析

2.1 测定条件的优化

（1）实验考察了Waters Atlantis™ d C18（150 mm× 2.1 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm× 2.1 mm，3.5 μm）、YTERRA®MS C18（150 mm× 2.1 mm，5 μm）、SHIMADZU C18（150 mm×2.1 mm，3.0 μm）色谱柱对化合物分离效果、峰型的影响。结果显示，SHIMADZU C18色谱柱效果最优，对化合物分离效果好、峰型尖锐，且响应比其他色谱柱好，因此选择SHIMADZU C1（8150 mm×2.1 mm，3.0 μm）色谱柱。

（2）考察0.1%甲酸铵水-乙腈、0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸铵-甲醇流动相对分析效果的影响。结果发现，0.1%甲酸-甲醇作为流动相时，分离效果和峰型达到最好。

（3）直接引入8 种标准溶液对其进行正离子模式和负离子模式采集，在相同的浓度下，甜蜜素、糖精钠、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜、甜菊糖苷和AK糖在负离子源模式下获得了较强的准分子离子信号，而爱德万甜在正离子源模式下获得了较强的准分子离子信号，比负离子模式要好。

（4）对碰撞能量等条件进行优化，确定目标化合物的离子对、碰撞能量和正反扫描方式，结果见图1。8 种混合甜味剂标准溶液总离子图见图1。

图1 8 种混合甜味剂标准溶液总离子图

2.2 线性相关性和方法检出限

以多反应监测离子模式对系列浓度标准物质混合溶液进行检测，分析各浓度与响应值的相关性，分别建立标准曲线。以信噪比S/N≥3 和S/N≥10作为方法检出限和定量限，线性关系、检出限和定量限结果见表3。8 种甜味剂在2 ～5 600 ng·mL-1线性关系良好，检出限为0.005 ～0.040 mg·kg-1，定量限为0.015 ～0.120 mg·kg-1。

表3 8 种甜味剂的标准曲线及检出限

2.3 方法回收率和精密度测定

称取蜜饯阴性样品，分别加入3 个混合浓度梯度甜味剂，重复测试3 次，结果见表4。结果表明，8 种甜味剂在蜜饯样品中的加标回收率为85.0%～106.1%，相对标准偏差均小于8.0%。

表4 蜜饯中8 种甜味剂的回收率和精密度

2.4 蜜饯中8 种甜味剂的测定

对市售的4 个品种蜜饯进行8 种甜味剂的含量测定，测定结果见表5。每种甜味剂的用量都不相同，种类也有所不同。从检测的结果来看，蜜饯行业使用的甜味剂种类相对较多。

表5 蜜饯含量测定结果

3 结论

本实验建立了高效液相色谱串联质谱法同时测定蜜饯中8 种甜味剂的测定方法，大大缩短了检测时间，提高了工作效率，减少了样品用量。该方法前处理简单、快速、高效。在满足国家对蜜饯中甜味剂的检测要求的前提下，与国家标准检测方法相比，大大提高了蜜饯检测样品的分析效率，也能更好地指导生产。