16S rDNA 鉴定泡椒凤爪中的腐败菌

孙玉侠,黄国保

（1.成都农业科技职业学院，四川成都 611100；2.广西农产资源化学与生物技术重点实验室，广西玉林 537000）

鸡爪富含胶原蛋白，营养价值较高，20 世纪70年代以前主要作为禽肉制品烹饪的下脚料，1978 年后，我国开始进口西方国家肥厚、型大、价廉的鸡爪，西南地区劳动人民以其食物的新鲜麻辣特色为出发点，创造性地将鸡爪与泡椒结合到一起，制作出具有鲜辣脆嫩风味的泡椒凤爪。

16S rDNA 分子生物学方法主要通过对微生物染色体上菌种之间差异性特异序列之间的比对鉴别微生物种属，灵敏度高，是鉴定微生物常用的分子生物学方法。本文选取胀袋变质样品与合格样品进行对照，分离培养纯化两组样品中的微生物，根据传统细菌菌体菌落形态，并结合16S rDNA 法鉴定泡椒凤爪腐败微生物，分析引起胀袋的特定腐败菌，从而为加工过程中微生物污染的靶向精准控制提供科学依据，延长产品货架期。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂

泡椒凤爪样品由重庆市计量质量检测研究院提供。

平板计数琼脂培养基、营养琼脂、EMB 琼脂培养基、MRS 琼脂培养基、CN 选择性琼脂培养基、MYP 琼脂培养基、Barid-Parker 琼脂培养基，北京陆桥技术责任有限公司。

细菌基因组提取试剂盒，天根（北京）生化科技有限公司；Mix Ex Taq 宝生物工程（大连）有限公司；PCR 引物的合成以及DNA 序列的测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；其余试剂为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 腐败菌的分离纯化

在无菌操作条件下，分别从合格样品和变质样品中选取鸡爪、泡椒和汁液共25 g，用无菌剪刀剪碎鸡爪，加入225 mL 无菌生理盐水，振荡1 min，然后取1 mL 上清液进行梯度稀释，选择10-1、10-2、10-33 个稀释度，涂布于不同的选择性培养基上，合格样品记为A，变质样品记为B，培养条件见表1。每个样品做3 个平行实验。从不同选择性培养基的平板上，挑取各种典型生长的菌落，随后在其各自培养基上划线分离2 ～3 次，得到纯化的单个菌落。

表1 各种菌的培养条件及选择性培养基

1.2.2 观察菌落特征和菌体形态

菌落特征：观察菌落表面呈现出的形状（褶皱、崎岖、平滑）、菌落表面形态（干燥、湿润）、菌落大小、边缘形状（缺刻状、光滑、波状、树枝状）、菌落颜色。

菌体形态：观察芽孢位置（中间、极端）、芽孢是否膨大、芽孢形状（杆状、椭圆、球状）。

1.2.3 DNA 的提取与纯化

挑取各纯化单菌落于营养肉汤中摇床过夜培养，吸取细菌培养液2 mL，参照细菌基因组DNA 提取试剂盒要求操作。

1.2.4 16SrDNA 的PCR 扩增

选用细菌通用引物5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3'；5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'[1]。先用20 μL 体系进行PCR 预实验，反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，设置52 ℃、53 ℃、54 ℃、 55 ℃、56 ℃、57 ℃[2]梯度变性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共30 个循环；最后72 ℃延伸7 min。

扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像检测，观察目标条带大小，并确定合适PCR 反应条件，最后选取50 μL 体系，即Mix Ex Taq（25 μL）、上游引物（1.25 μL）、下游引物（1.25 μL）、模板 （1.25 μL）、重蒸水（21.25 μL）进行PCR 反应，割胶回收并纯化，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。对照实验，DNA 模版替换为重蒸水。

2 结果与分析

2.1 泡椒凤爪腐败菌的菌落特征和菌体形态

经革兰氏染色镜检观察各种菌体的形态结构，并结合各腐败菌在琼脂固体培养基上的菌落特征进行判断，结果见表2。表2 中A 为合格样品，B 为变质样品，A1～A4为合格样品分离检出的菌株；B1～B10为变质样品分离检出的菌株。

表2 泡椒凤爪中分离到的各菌株的形态特征

如表2 所示，有4 种微生物在两种样品中均有检出，根据微生物形态分析可知，两种样品均有乳酸菌生长，因为泡椒凤爪的pH 值偏酸性，pH 值为4.5 ～5.0，且泡椒凤爪中的泡椒为乳酸菌发酵，乳酸菌是正常的有益菌，可抑制腐败菌的生长[3]。B 组样品为胀袋变质泡椒凤爪，初步判断引起腐败的为葡萄球菌、假单胞菌、芽孢杆菌，至于样品在腐败变质的过程中微生物区系的变化和优势腐败菌的腐败机制还不清楚，有待进一步研究。

2.2 DNA 提取、PCR 扩增及测序

预实验证实退火温度设置为56 ℃较适宜，PCR扩增16S rDNA 基因片段的凝胶成像图，测序结果也表明，PCR 实验所获得的扩增产物为实验目的菌株16S rDNA 基因片段。测序结果见表3。

表3 分离细菌的16S rDNA 序列与NCBI 数据库的比对结果

PCR 测序结果与细菌形态学表现基本一致，其中A1、B1魏斯氏菌属，是兼性厌氧菌或微需氧菌，常见于泡菜中，也是国外香肠制品的发酵菌之一[4-5]，在正常泡椒凤爪和腐败样品中均存在，可能是泡椒的发酵菌。

Staphylococcus pasteuri和Staphylococcus cohnii、Staphylococcussp. 都 属 于 葡 萄 球 菌 科，Staphylococcus pasteuri兼性厌氧，产酸不产气，无法引起泡椒凤爪涨袋变质；Staphylococcus cohnii被医学研究中心证明抗药性较高，在我国广西及湖北部分鸭养殖场有发现，但其无毒力因子基因检出，目前还未有鸡养殖场报道，但鸡鸭有一些相似的生活特性，因此推测其可能来源于鸡养殖场；健康禽类的皮肤、羽毛、肠道等都有Staphylococcussp.存在，它是家禽孵化、饲养、加工环境中的常见微 生物。

Bacillus subillis常见于饲料中，可改善鸡肠道菌群，促进吸收；Bacillus amyloliquefaciens在肉鸡中可用来改善肠道免疫功能，具有抗氧化的作用；Bacillus licheniformis可降解重金属，有效提高肉鸡的生长性能、免疫力和抗氧化能力。Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus licheniformis可能都是来源于鸡饲料残留。

Pseudomonassp.在自然界分布广泛，主要分布在潮湿环境中。泡椒凤爪产品有凤爪、泡椒、泡椒液，适宜Pseudomonassp.生长。Pseudomonas aeruginosa是一种条件致病菌，在4℃不生长，可采用4 ℃冷藏泡椒凤爪，来抑制其生长繁殖；Pseudomonas alcaliqenes，适宜温度35 ℃，可能来源于水源污染。

变质样品比合格样品多出的微生物可能是导致泡椒凤爪变质的腐败菌，但由于未接种合格样品且未进行腐败机制研究，先不排除，结合上文及表3来看，引起泡椒凤爪腐败变质可能是Staphylococcus cohnii、Bacillus amyloliquefaciens、Pseudomonas alcaliqenes、Pseudomonas aeruginosa。建议加强鸡爪采购源头治理，加强加工过程管理，采用4 ℃冷链储藏销售，减少微生物污染。

3 结论

本实验通过传统细菌形态学和16SrDNA 检测泡椒凤爪中腐败菌10 种，引起泡椒凤爪变质可能有Staphylococcus cohnii、Bacillus amyloliquefaciens、Pseudomonas alcaliqenes、Pseudomonas aeruginosa。腐败菌变变质机制、变质途径等有待进一步研究分析。