UPLC-MS/MS 法检测乳制品中3 种内源性雌激素及其代谢产物的含量

樊亚光，朱盈蕊，荣剑锋，李 琦，李杜娟

（郑州市食品药品检验所，河南郑州 450000）

类固醇类激素在生理学中起着多种生物反应的调节器作用，包括细胞代谢、炎症、免疫功能、压力管理、发育和生理学等。类固醇激素又称为甾体激素，是由肾上腺皮质、卵巢和睾丸中的胆固醇通过代谢途径合成的，类固醇激素的产生或代谢异常是内分泌疾病发生的原因，甾体激素失调会造成女性月经失调、青春期提前、乳房提前发育等异常现象；也会造成男性精子质量下降等异常情况[1]。雌激素可造成机体免疫失调等病理反应[2]。雌激素活性物质主要分为内源性雌激素和外源性雌激素，内源性雌激素主要是人体和动物体自身分泌的激素，如雌醇、雌酮、雌二醇等[3]。

当前，动物源性食品中雌激素的检测方法主要包括液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-串联质谱法、免疫分析法等[4-5]。但是因为前体和代谢物结构相似，且在生物样品中浓度较低，很难同时确定多种雌激素，对日常检测造成了不便[6]。常用的免疫分析法具有基质干扰，与结构相似的代谢物交叉激活的准确性不足，灵敏度不高，检测范围有限[7]等缺点。基于质谱的色谱方法，如GC-MS/MS和LC-MS/MS，被认为是目前主流的检测方法，但气相色谱-质谱联用法需要衍生化步骤，使雌激素在气相中挥发或增加电离性质，但衍生步骤、非特异性质谱裂解和结合雌激素的可能水解会损害样品的通量和准确性，阻碍其在实际应用中的实用性[8-9]。为了检测复杂样品中的低水平雌激素，进行UPLCMS/MS 检测前的样品制备至关重要。如今检测已经可以采用多种样品制备技术，现有方法分析一次只能评估一种或两种类固醇激素，而同时测量多种类固醇可节省极大的物料成本及时间成本。现有方法多采用正负离子相结合的方式，而本文开发和验证了液相色谱-质谱/质谱的新方法，只采用正离子模式，无需任何衍生步骤，使用0.1%甲酸水和0.1%甲酸甲醇溶液作为流动相，通过Oasis PRiME HLB Cartridge 固相萃取柱纯化样品，深入研究了内源性雌激素的检测，通过不同前处理方法之间的比较，可以一次定量分析包括雌激素、孕激素、雄性激素等3 种内源性激素及其衍生物。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂

甲酸（电子纯，美国fisher 公司）；乙腈（色谱纯，美国fisher 公司）；乙酸（色谱纯，美国fisher 公司）；雌酮（Estrone、E1）、雌二醇（Estradiol、E2）、雌三醇（Estriol，E3），纯度均大于97%，购自TRCCANADA 公司；实验用水为超纯水。3 种标准物质信息见表1。

表1 3 种标准物质信息

1.1.2 仪器

Waters®Xevo TQ-S 微串联质谱仪配电喷雾电离（ESI）源，Waters 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准储备液的配制

使用十万分之一天平准确称取3 种雌激素及其衍生物各10 mg，分别加入到3 个10 mL 的棕色容量瓶中，使用适量甲醇溶解，再进行定容，摇匀，配成 1.0 mg·mL-1的标准溶液储备液，-18 ℃避光存放。使用移液枪分别吸取3 种雌激素各0.1 mL，使用70%甲醇水定容至10 mL 容量瓶中，配制成10 mg·L-1的中间液，使用时根据需要配制成5 ng·mL-1、 10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1的标准溶液。所有中间液避光存放在-18 ℃冰箱中。

1.2.2 样品前处理

使用含0.1%甲酸的酸化乙腈对样品进行提取，与阳性基质样品涡旋振荡15 min，超声提取 15 min，-4 ℃低 温 离 心，10 000 r·min-1离 心 15 min，取上清液4 mL 净化。净化柱选择Oasis PRiME HLB Cartridge。将上清液转移至固相萃取柱，重力过柱，收集滤液，直接过滤膜进样。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

为了避免不同填料的色谱柱的影响，本研究选择Waters®Acquity UPLC C18HILIC BEH（100 mm× 2.1 mm，2.1 μm）、Waters®Acquity UPLC C18BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Waters®Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）3 种 色 谱 柱。经 对 比 后 发 现，Waters®Acquity UPLC C18BEH （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离效果最好。流动相A为含有0.1%甲酸的水溶液，流动相B 为含有0.01%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱见表2，柱温40 ℃，流速：0.2 mL·min-1，进样量10 μL。

表2 流动相条件

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），采用正离子快速切换扫描模式；毛细管电压：3. 0 kV（ESI+）；锥孔电压：35 V（ESI+）；锥孔气流量：150 L·h-1；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；脱溶剂气流量： 1 000 L·h-1；碰撞气流速：0.18 mL·min-1；雾化气压力：0.7 MPa；采用多离子反应监控（MRM）扫描方式。质谱优化MRM 参数见表3。

表3 3 类内源性雌激素的质谱优化参数

2 结果与分析

2.1 标准曲线

使用70% 甲醇水溶液将中间液配制成5 ～ 500 ng·mL-1的标准曲线，以峰面积（Y）为纵坐标，以浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线。结果显示3 种内源性雌激素及其衍生物在5 ～500 ng·mL-1线性良好。相关系数（R2）均≥0.990，检出限为0.5 ～ 1.0 ng·mL-1，定量限为1.5 ～3.0 ng·mL-1，详见表4。

表4 3 类内源性雌激素及其代谢物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

2.2 回收率与精密度

为了评价该方法的有效性，测定了回收率和日内精密度等参数。将高（70 ng·mL-1）、中（40 ng·mL-1）、低（10 ng·mL-1）3 个浓度的标准溶液加入空白阴性样品，回收率为80.20%～105.92%，日间稳定性（n=3）为4.7%～11.5%，详见表5。这些结果表明，该方法所提供的稳定性是合理的，适用于常规分析。

表5 3 类内源性雌激素及其代谢物的加标回收率及相对标准偏差（n=3）

3 结论

本文采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了一种同时测定乳制品中3 种内源性雌激素的检测方法，无需衍生化和复杂步骤，选择含0.1%甲酸的酸化乙腈为提取溶剂，Oasis PRiME HLB Cartridge 固相萃取柱净化，使用含0.1%甲酸水溶液和含有0.1%甲酸甲醇溶液为流动相，得出的结果线性关系良好。本方法快速、便捷，应用范围广，具有较高的灵敏度、选择性和准确性，易于实现高通量处理，适用于乳制品中内源性雌激素及其代谢物含量的分析。此外，该方法还有较强的扩展性，对于多种基质中内源性雌激素及其衍生物的检测都具有可借鉴性，可进一步开展新的研究。