蜂王浆中10-羟基-2-癸烯酸含量测定的不确定度评定

黄洁洁，王玲玲，邢薇薇

（安徽省食品药品检验研究院（安徽国家农副加工食品质量监督检验中心），安徽合肥 230051）

蜂王浆是由工蜂分泌的呈白色或淡黄色浆状物，含有多种功能因子，其中最受关注的是10-羧基-2-癸烯酸（10-HDA）。10-HDA 是一种不饱和脂肪酸，由工蜂上颚腺分泌[1]，是蜂王浆所特有的高效生物活性物质，因其特殊的药理和保健作用，受到医疗领域和保健食品领域的广泛关注[2]。在食品领域，蜂王浆被视为一种天然的保健产品，而10-HDA 是蜂王浆的核心品质指标，《蜂王浆》（GB 9697——2008）根据10-HDA 含量要求分为合格品（含量≥1.4%）和优等品（含量≥1.8%）两个等级[3]，即10-HDA 含量越高，蜂王浆品质越好。在食品安全监管工作中发现，市售蜂王浆存在掺假掺杂、以次充好现象，品质低劣的产品中10-HDA 含量指标未达“合格线”。为维护食品安全和良好的产品市场秩序，蜂王浆中的10-HDA 含量是国家抽检蜂王浆类产品的重要监测指标。因而，评价此类产品检测结果的准确性和科学性有重要意义。

测量不确定度是被测量的客观值在某一量值范围内的评定，不确定度的值越小，表示测量的质量越高。其概念在计量基准和标准物质研究中应用广泛，并渗透到更宽广的测量分析领域。为了更准确地表达结果和质量评定，本文依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1——2012）[4]，对蜂王浆中的10-HDA 的不确定度进行评定，分析不确定度来源，确保评定结果质量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试样为某蜂王浆产品。

10-羟基-2-癸烯酸标准品（10-HDA，阿尔塔公司）；无水乙醇（优级纯）；对羟基苯甲酸甲酯；甲醇（色谱纯）。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（岛津，配紫外检测器）；高速离心机；电子天平（梅特勒）。

1.3 样品前处理

称取解冻后的样品0.5 g，加入0.03 mol·L-1的盐酸溶液1 mL、水2 mL，涡旋混合后加入无水乙醇 30 mL，加入对羟基苯甲酸甲酯（内标，约0.65 mg·mL-1）10 mL，用无水乙醇稀释并定容至50 mL，超声15 min后在3 000 r·min-1下离心10 min，上清液经0.45 μm 滤膜过滤，进样[3]。

1.4 标准溶液配制

10-HDA 标准储备溶液配制：精密称取25 mg10-HDA 标准品，无水乙醇溶解，移入10 mL 容量瓶并定容至刻度，制成浓度为2.5 mg·mL-1的标准储备液。

10-HDA 标准使用溶液配制：分别吸取10-HDA标准储备溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL 和 2.0 mL至10 mL容量瓶中，精密加入2.0 mL内标溶液，用乙醇定容至刻度，制成标准测试液。

1.5 色谱条件

色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：甲醇+水+0.03 mol·L-1盐酸（55+35+10，v∶v∶v）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：210 nm；进样量：4 μL。

1.6 数学模型

试样中10-HDA 计算公式为

式中：X为10-HDA 的含量，%；F为校正因子；Ai为试样溶液中10-HDA 峰面积；As为试样溶液 中内标物峰面积；ms为内标物质量，g；mi为试样质量，g。

2 结果与分析

根据检测过程和数学模型，确定该实验的不确定度主要来源于标准溶液配制引入、拟合标准曲线引入、试样制备过程引入和试样测量重复性引入。

2.1 标准溶液配制引入的相对标准不确定度

2.1.1 标准物质引入的相对不确定度

10-HDA 标准品购自阿尔塔公司，标准物质证书显示其不确定度为0.5%，采用均匀分布，包含因子k=2，因此，相对标准不确定度为

2.1.2 标准物质称量引入的相对不确定度

称量使用的天平检定证书，其最大允许误差为±0.1 mg，假设为均匀分布，称取标准物质引入的相对标准不确定度为

2.1.3 标准储备液配制引入的相对不确定度

（1）容量瓶校准引入的相对不确定度。根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196——2006）[5]，10 mL A 级容量瓶允差为±0.020 mL，按矩形分布，引入的相对标准不确定度为

（2）温度引入的相对不确定度。乙醇的膨胀系数为7.5×10-4℃-1，实验温度变化范围为（20±3）℃，按照均匀分布，温度差异引起的相对标准不确定度为

则标准储备液配制引入的相对不确定度为

2.1.4 内标物质引入的相对不确定度

在本试验测定10-HDA 过程中，标准工作液和样品待测液加入的是同一配制的对羟基苯甲酸甲酯内标液，其纯度和配制不影响样品中10-HDA的含量测定，内标物质引入的不确定度仅由体积产生，因此其不确定度在标准使用液配制过程中 讨论[6]。

2.1.5 标准使用液配制引入的相对不确定度

标准使用液配制过程产生的不确定度主要由玻璃量具、移液枪所引入，室温变化影响因素较小，忽略不计，详见表1。10 mL A 级容量瓶使用5 次，引入的不确定度同2.1.3。

表1 标准使用液配制过程中移液管、移液枪引入的相对不确定度

由标准使用液配制引入的相对标准不确定度为

综合上述因素，标准溶液配制引入的相对标准不确定度为

2.2 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度

本试验采用5 个不同浓度的标准系列工作液进行测量，用HPLC 法测试其峰面积响应值，以10-HDA 溶液与内标溶液的浓度比值为横坐标x，以10-HDA 溶液与内标溶液的峰面积比值为纵坐标y，线性回归方程为y=4.349 08x+0.021 97，相关系数R=0.999 9。回归直线标准偏差按式（2）计算，10-HDA 校准曲线引入的相对不确定度按式（3） 计算。

式中：Ai为拟合工作曲线中各点的标准峰面积与内标物质峰面积的比值；Ci为拟合曲线中各标准点的浓度，μg·mL-1；b为拟合工作曲线的斜率；a为拟合工作曲线的截距；N为拟合曲线中点的个数，N=5；SA为拟合工作曲线的标准偏差；p为样品的测定次数，p=1；C为样品浓度，C——为标准系列浓度的平均值，μg·mL-1。

计算得urel(C)=0.005 95，则标准曲线引入的相对标准不确定度为

2.3 试样制备过程引入的相对标准不确定度

2.3.1 试样称量引入的相对标准不确定度

电子天平检定证书标出的线性误差为±0.1 mg，假设为均匀分布，样品称量引入的相对标准不确定度为

2.3.2 试样定容体积引入的相对不确定度

50 mL A 级单标线容量瓶允差为±0.05 mL，u(V1)=0.000 58；10 mL A 级单标线吸量管允差为±0.02 mL，u(V2)=0.001 15；2 mL A 级单标线吸量管允差为±0.010 mL，u(V3)=0.002 89。因此，试样定容体积引入的相对标准不确定度为

综上，试样制备过程引入的相对标准不确定度为

2.4 试样测量重复性引入的相对标准不确定度

同一操作者对蜂王浆中10-HDA 含量进行6 次重复测定，结果分别为1.046%、1.041%、1.034%、1.042%、1.039%和1.046%，平均值为1.0413%，标准偏差S(X)=0.004 6。

2.5 合成不确定度

由上述各相对标准不确定度分量合成蜂王浆中10-HDA 相对标准不确定度为

2.6 扩展不确定度

按照包含因子k=2（置信水平95%），计算出高效液相色谱法测定蜂王浆中10-HDA 含量的相对扩展不确定为urel=k×urel(X)=2×0.019 6=0.032 9，扩展不确定度为U=1.041×0.039 2=0.040 8%。

2.7 测量结果及不确定度的报告

蜂王浆中10-HDA 测定结果可表示为X=（1.041±0.040 8）%，k=2。

3 结论

本文采用HPLC 法测定蜂王浆中10-HDA 含量时，通过不同方面的分析，确定不确定度的来源及不确定度分量，发现主要影响因素为标准溶液配制引入的不确定度以及标准曲线拟合引入的不确定度。依据本研究结果，可通过在测定过程中选用精度较好的量器、规范操作移液管和容量瓶，确保配制标准工作溶液浓度的准确性，通过定期检定仪器，稳定仪器状态等方式降低测量的不确 定度。