基于核酸适配体的癌症诊断新技术研究进展

黄晓明,陈勇,牛会敏

(1.福建生物工程职业技术学院药学系,福建福州 350007;2.厦门大学附属东方医院福建省适配体技术重点实验室,福建福州 350025;3.联勤保障部队第九〇〇医院全军临床检验医学研究所,福建福州 350025)

癌症是导致死亡率最高的疾病之一,严重威胁着人类的健康和社会的发展。通过对癌症的有效早期诊断,可以尽早进行治疗以降低癌症的病死率。尽管癌症早期诊断技术近年来有了很大的进展,但这些方法大多存在侵入性、特异性低、灵敏度低、技术要求高、成本高等局限。因此,寻找新的癌症早期诊断方法迫在眉睫。近年来,已有研究发现核酸适配体(Aptamer)具有独特的三维结构,可特异性地结合各种靶标,具有分子量小、合成简单、稳定性好、免疫原性小等优点,展现出传统的免疫学分子和化学分子识别所无可比拟的优势,被视作可替代单克隆抗体的新型分子,在癌症诊断方面具有广阔的应用前景。本文介绍核酸适配体在几种常见癌症诊断中的应用进展。

1 核酸适配体概述

核酸适配体是长度为20～80个核苷酸的单链DNA或RNA,由于分子内相互作用而折叠成独特的二级结构,能够以高亲和力和特异性结合靶标[1-3]。通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),从核酸分子文库中得到寡核苷酸片段。自从SHANGGUAN等[4]首次开发了一种基于指数富集的全活细胞配体选择新方法Cell-SELEX以来,适配体选择的靶标范围从无机分子[5]、有机分子[6]、生物大分子[7]扩展到全活细胞[8]。

核酸适配体是基于核苷酸之间严格的碱基互补配对识别能力和亲和力而设计的人工合成寡核苷酸,其特性十分类似于单克隆抗体的功能。与抗体相比,核酸适配体具有高特异性[9]、低毒性[10]、低成本[11]、易于合成[12]、易修饰[13]和低免疫原性[14]等优点。与此同时,核酸适配体在结合亲和力方面也可与抗体竞争,解离常数(Kd)可达pM水平[15]。此外,核酸适配体具有高度特异性,可以区分仅因小分子[16]中的一个甲基而不同的靶标,或大蛋白[17]中的一个氨基酸而不同的靶标。

核酸适配体作为一类新型识别分子,目前已发展成为备受关注的新型检测工具,广泛应用于癌症的早期诊断,并显示出巨大的应用潜力和广阔的应用前景。

2 核酸适配体在癌症诊断中的应用

2.1 在胃癌诊断中的应用胃癌是全球癌症死亡的主要原因之一。尽管诊断方法不断改进,但到目前为止,尚未实现早期检测,而提高胃癌的早期诊断水平将有助于早期胃癌患者的良好预后。

循环肿瘤细胞在液体活检中是肿瘤诊断和预后的重要生物标志物。然而,循环肿瘤细胞数与胃癌之间的关系却鲜有定量研究。LI等[18]提出了一种简单、低成本、双适配体(EpCAM和PTK7)修饰的免疫磁性Fe3O4颗粒(IMNs),用于胃癌患者异质循环肿瘤细胞的高效捕获和下游分析。原发性胃癌组织中可见PTK7高表达,且PTK7与EpCAM表达呈显著负相关。以MGC-803和BGC-823细胞为循环肿瘤细胞模型,获得的双靶向IMNs能够区分高表达或低表达EpCAM和PTK7的细胞,提高了胃癌循环肿瘤细胞识别的准确性。此研究为进一步开展循环肿瘤细胞相关诊断和个体化治疗的研究提供了重要参考。

外泌体是一种直径为30～150 nm的纳米囊泡,具有磷脂双分子层膜结构,可以被各种细胞分泌并释放到各种体液中,包括尿液、血液、眼泪、精液等,是液体活检的理想对象。许多外泌体蛋白质和miRNA被认为是潜在的癌症生物标志物,对外泌体进行液体活检在癌症的早期诊断、监测和预后评估方面引起了广泛关注。HUANG等[19]开发了一种基于分支滚圈扩增(BRCA)和靶向特异性外泌体的适配体的胃癌外泌体荧光检测方法,该方法对目标外泌体具有较高的特异性,检出限为4.27×104/mL,这种基于适配体的生物传感器在胃癌的早期诊断中具有潜力。HUANG等[20]提出了一种无标签的电化学适配体传感器,用于胃癌外泌体的特异性检测。该平台包含抗CD63抗体修饰金电极和胃癌外泌体特异性适配体,该适配体传感器对胃癌外泌体具有较高的选择性和敏感性,检出限为9.54×104/mL。虽然基于外泌体的液体活检已被应用于包括癌症在内的疾病的诊断和监测,但基于代谢水平的外泌体的疾病检测鲜有报道。CHEN等[21]构建了特异的核酸修饰体耦合的金修饰多态碳(CoMPC@Au-Apt),用于捕获早期胃癌患者和健康对照者的尿液外泌体,并在无需额外洗脱过程的情况下进行后续的外泌体代谢模式分析,这项研究说明了外泌体的高特异性和外泌体代谢分析在胃癌的早期诊断和监测中具有广阔前景。

2.2 在肺癌诊断中的应用肺癌是世界上最常见和最致命的癌症。肺癌患者预后较差,早期诊断和治疗是提高肺癌患者生存率的关键。目前已经发展出几种检测肺癌的常规方法,但这些方法大多成本高、耗时长、灵敏度低,而且还需要精密仪器[22-23]。为了克服这些因素,需要开发新的方法和试剂以实现肺癌的早期诊断。

BASHMAKOVA等[24]建立了一种基于一对适配体作为敏感元素和重组Ca2+调控光蛋白传感元件作为高灵敏度生物发光报告的固相分析方法,用于检测血液中循环的肺肿瘤元素。ZHAO等[25]使用了一种新的改良SELEX,称为血清-SELEX,分离出可以特异性结合肺癌血清的适配体,而无需事先了解其靶点,该适配体在肺癌早期诊断中具有潜在的应用价值。CHEN等[26]设计了一个末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的延伸聚合适配体探针(TEPAP),该探针具有较高的灵敏性,能特异性识别NCI-H446细胞,在小细胞肺癌诊断中具有很大的潜力。

基于外泌体的体外液体活检为快速、可靠地检测肺癌提供了良机。ZHAO等[27]提出了一种结合功能化膜的自动化离心微流体盘系统(Exo-CMDS)分离和富集外泌体,然后通过一种新型的适配体荧光系统(Exo-AFS)处理外泌体表面蛋白,从而有效地检测外泌体表面蛋白。与传统技术相比,Exo-CMDS和Exo-AFS具有成本低、速度快、纯度高、灵敏度高、特异性强等优势,为肺癌早期检测提供一种切实可行的方法。

2.3 在乳腺癌诊断中的应用乳腺癌是世界范围内女性最常见的癌症,早期检测对于改善预后和降低病死率至关重要。越来越多的研究表明,外泌体作为许多癌症的早期诊断生物标志物和调节因子有很大的潜力。ESPOSITO等[28]开发了一种新的差异SELEX策略,称为Exo-SELEX,通过选择一组抗核酸酶序列,优化了一个高亲和力适配体(ex-50.T),使其能够特异性识别乳腺癌细胞或患者血清样本中的外泌体。

乳腺癌的分子分型因其在个性化治疗和预后方面的潜力而备受关注。然而,目前的方法不能用于精确的分型,因此在临床实践中提出了挑战。LIU等[29]开发一种基于细胞特异性单链DNA(ssDNA)适配体的荧光探针,通过改进的Cell-SELEX方法对乳腺癌进行精确的分子分型。适配体sk6Ea对SK-BR-3乳腺癌细胞具有较高的特异性,不仅能在体外和体内区分乳腺癌分子亚型,而且与其他和乳腺癌相关的适配体相比,还能将SK-BR-3乳腺癌细胞与其他癌细胞和正常细胞进行区分。这种基于适配体的探针是一种快速、高灵敏度的乳腺癌分子分型工具,在乳腺癌分子分型的鉴别、诊断和靶向治疗方面具有广阔的应用前景。

2.4 在结直肠癌诊断中的应用结直肠癌(CRC)是人类最常见的癌症类型之一。和大多数癌症一样,结直肠癌的存活率在很大程度上取决于疾病诊断阶段。PU等[30]使用荧光标记的抗EpCAM 19 DNA适配体(SYL3C-CY3)作为一种有效的分子探针,开发了一种基于适配体的免疫荧光方法,用于诊断来自结直肠癌患者的组织样本中的EpCAM20阳性结直肠癌细胞。MAIMAITIYIMING等[31]基于细胞的SELEX方法筛选一种高亲和力DNA适配体,能够选择性靶向结直肠癌Caco-2细胞。WANG等[32]基于氧化石墨烯(GO)-DNA适配体(CD63和EpCAM适配体)相互作用,开发了一种DNase I酶辅助荧光扩增结直肠癌外泌体检测方法。

早期诊断转移性结直肠癌(mCRC)对改善治疗和延长生存期至关重要。CHEN等[33]设计了一种基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器(FAM-W3-GO),用于无需洗涤流程的mCRC细胞的一步敏感检测。在分析过程中,GO与FAM-W3结合,淬灭FAM的荧光。当靶细胞加入后,随着FAM-W3的释放,绿色荧光会恢复。因此,一种用于mCRC细胞检测的高灵敏度适配体传感器是通过靶细胞有无时的荧光变化来实现的。由于对W3的特异性识别,FAM-W3-GO可用于复杂环境下mCRC细胞的检测,检测程序简单,无需洗涤步骤即可实现一步定向检测。

2.5 在前列腺癌诊断中的应用前列腺癌(PCa)是世界上最常见的癌症之一,也是许多国家男性癌症相关死亡的主要原因。早期诊断对于PCa的治疗和预后非常重要。GU等[34]利用聚乙二醇(PEG)和抗PSMA适配体修饰多壁碳纳米管(MWCNTs),研制了一种新型纳米声造影剂。结果表明,与传统造影剂相比,改进的多壁碳纳米管具有更好的可视性和准确性,能够更有效地靶向前列腺癌细胞。ABRAHAM等[35]开发了一种与肿瘤特异性靶向DNA适配体生物偶联的钙-磷硅酸盐纳米颗粒,也称为纳米外套(NJs),用以增强前列腺癌的近红外荧光成像,以提高早期癌症的检测。HASSANI等[36]使用丝网印刷碳电极(SPCE)修饰金纳米颗粒(Au NPs)偶联硫酰化适配体,设计了一种简单、高灵敏度、经济的无标签电化学适配体传感器,用于前列腺特异性抗原(PSA)的检测(PSA是前列腺癌诊断的金标准生物标志物),该法提供了准确、可重复和高灵敏度的临床血清样本PSA最低水平的测定。

2.6 在其他癌症诊断中的应用除上述癌症外,基于核酸适配体的检测技术在其他人类常见癌症诊断中也被广泛应用。ZHAO等[37]制备了一种基于磷脂酰肌醇-3(GPC3)适配体介导的超微超顺磁性氧化铁(USPIO)的靶向MRI分子探针,结果证实了该探针对表达GPC3的肝癌具有靶向成像作用。WANG等[38]以宫颈癌为模型,采用Cell-SELEX方法,以正常上皮细胞为对照进行筛选,发现了一种特异性与宫颈癌细胞高亲和力结合的DNA适配体C-9S,该适配体具有成为宫颈癌早期检测、体内成像和靶向传递进一步研究的分子探针的巨大潜力。TSAI等[39]设计了一种集成微流体系统,使用CX-BG1-10-A适配体检测卵巢癌源性BG-1细胞,检测步骤包括红细胞裂解、白细胞耗尽和循环肿瘤细胞分离,这使其比基于抗体的检测系统更加敏感。KIM等[40]报道了一种EN2特异性适配体,以及一种灵敏且特异的酶联寡核苷酸测定法(ELONA),该法依靠适配体介导的杂交链式反应(HCR)生成DNA纳米结构,结合EN2并同时放大信号,用于膀胱癌生物标志物EN2的快速灵敏比色检测。GAO等[41]开发了一种基于适配体的癌胚抗原(CEA)微芯片电泳分析方法,该方法将CEA的特定适配体及其互补链与磁珠结合。在CEA存在的情况下,互补链从珠子中释放出来,然后与另一个FAM标记的DNA结合,开始信号传递过程。该方法对CEA具有较高的敏感性和特异性,检出限为68 pg/mL,表明基于适配体的检测方法可显著提高胰腺癌的早期诊断率。

3 总结与展望

核酸适配体作为一类新型检测工具,已被广泛应用于多种癌症的早期诊断。但目前核酸适配体在实际应用方面还有诸多问题需要解决,例如,在生物体液中发现大量核酸酶可以降解核酸适配体,且核酸适配体在体内半衰期较短,因此,有必要设计更加稳定的核酸适配体,以防止核酸酶的裂解。此外,核酸适配体的本质是一段寡核苷酸,对其毒性研究实验很少,对人体是否会产生不良影响还有待进一步研究。