痛泻要方对腹泻型肠易激综合征大鼠粪便代谢组学的影响

陈 璇，杨 欣，于晓雯，卞 勇，朱 磊，沈 洪

(1. 苏州科技城医院，江苏 苏州 215153;2. 镇江市中医院，江苏 镇江 212003;3. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210000;4. 南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210000)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是以腹痛、腹胀或腹部不适为主要症状，与排便相关或伴随排便习惯如频率和(或)粪便性状改变的一种功能性疾病[1]。根据粪便性状改变将IBS分为腹泻型(IBS-D)、便秘型(IBS-C)、混合型(IBS-M)及不确定型(IBS-U)，其中以IBS-D最为多见[2]。目前，IBS的发生机制尚不明确，可能是多种因素共同作用的结果，如精神心理障碍、内脏高敏感、肠道菌群失调、脑肠互动异常等[3]。所以西医的对症治疗解决不了IBS复杂的发病机制，而中医药多靶点、多通路的作用过程更适合IBS的治疗[4]。中医药在IBS-D治疗方面积累了丰富的经验。一项关于IBS-D中医证候规律的研究显示，肝郁脾虚证为其最常见证型，占33.66%[5]。另一项文献检索研究显示，关于IBS-D肝郁脾虚证的治疗以痛泻要方为基础方加减的占84%[6]。由此可见，痛泻要方是治疗IBS-D肝郁脾虚证的主要方剂。多篇荟萃分析显示，痛泻要方治疗IBS-D临床疗效较好，且安全性高[7-8]。但是目前痛泻要方作用机制仍不够系统和全面，特别是在代谢组学研究方面，未见有粪便代谢组学方面的研究报道。故本研究拟通过代谢组学方法探讨痛泻要方干预后大鼠粪便中内源性代谢产物的变化规律，以阐释其药理作用，为进一步研究提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1动物 健康雄性SPF级SD大鼠40只，体重180～200 g，购于杭州医学院，实验动物使用许可证号：SCXK(浙)2019-0002。本实验动物饲养于南京中医药大学动物实验中心，实验室环境保持温度和相对湿度分别在20～25 ℃及40%～60%，适应环境并自由饮食3 d。本实验获得南京中医药大学动物伦理委员会批准(202104A029)。

1.2药材与试剂 痛泻要方颗粒剂(炒白术30 g、炒白芍20 g、炒陈皮15 g、炒防风10 g)由江阴天江药业有限公司提供；匹维溴铵片(法国Abbott Products公司，进口药品注册证号H20120127)；番泻叶(苏州市天灵中药饮片有限公司，批号：200221010)。根据公式[标准大鼠每克用药量=成人用药量×大鼠与人体体表比(0.018)/标准大鼠体重(200 g)]配置药液，番泻叶、匹维溴铵片及痛泻要方配方颗粒成人用药量分别按50 g、150 mg、75 g计算。将番泻叶加水浸泡30 min，煎煮8 min，取上清液，浓缩至最终浓度相当于含生药0.45 g/mL药液。匹维溴铵片及痛泻要方配方颗粒研粉，溶于蒸馏水中，分别配制成1.35 mg/mL、0.675 g/mL浓度悬混液。以上药液4 ℃冰箱保存备用。HPLC级别Methanol、Acetonitrile、Formic Acid和LC-MS级别Water由Fisher Chemical及CNW厂家提供，HPLC级别2-Propanol由Merck厂家提供，≥98%的2-Chloro-L-Phenylalanine由Adamas-beta提供。

1.3仪器与设备 Vanquish Horizon system UHPLC液相色谱系统(Thermo Scientific)，Q-Exactive HF-X质谱仪(Thermo Scientific)，NewClassic MF MS105DU电子天平(METTLER TOLEDO)，Centrifuge 5424R、5430R冷冻离心机(Eppendorf)，SBL-10TD控温超声波清洗机-10L(宁波新芝生物科技股份有限公司)，Wonbio-96c多样品冷冻研磨仪(上海万柏生物科技有限公司)，LNG-T88台式快速离心浓缩干燥器(太仓市华美生化仪器厂)，JXDC-20氮气吹扫仪(上海净信实业发展有限公司)。

1.4实验方法 所有大鼠适应性饲养3 d后随机分为4组，每组10只。除空白组外，其余组大鼠参考文献[9-10]方法，采用慢性束缚应激加番泻叶灌服法建立IBS-D肝郁脾虚证模型：造模大鼠实验前10 h禁食不禁水，予以番泻叶水煎剂1 mL/100 g灌胃，每日1次，灌胃后用宽透明胶带束缚大鼠肩部及前肢和胸腹部，使大鼠无法用前肢抓搔头面，每天定时约1 h，连续造模14 d。之后空白组及模型组大鼠给予1 mL/100 g蒸馏水灌胃，痛泻要方组及匹维溴铵组给予1 mL/100 g相应混悬液灌胃，均每日1次，连续灌胃14 d。每7 d称大鼠体重1次，以调整药量。

1.5标本收集与处理 末次灌胃后处死大鼠，收集直肠中粪便，EP管分装，-80 ℃冰箱保存。实验时从每份样本中取50 mg粪便样品至1.5 mL离心管中，并加入400 μL提取液(甲醇∶水=4∶1)，含0.02 mg/mL的内标(L-2-氯苯丙氨酸)，涡旋混匀30 s后，低温超声提取30 min(5 ℃，40 kHz)；静置于-20 ℃，30 min，再离心15 min(13 000×g，4 ℃)，移取上清液，氮气吹干；加入100 μL复溶液(乙腈∶水=1∶1)复溶；涡旋混匀30 s，低温超声萃取5 min(5 ℃，40 kHz)；离心10 min(13 000×g，4 ℃)，移取上清液至带内插管的进样小瓶中上机分析；另外，每个样本分别移取20 μL上清液混合后作为质控样本。

1.6LC-MS检测 使用赛默飞公司的超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱UHPLC-Q Exactive HF-X系统进行LC-MS分析。色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm;Waters,Milford,USA)；流动相A为95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸)，流动相B为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水(含0.1%甲酸)，进样量为2 μL，柱温为40 ℃。

1.7数据处理分析方法 先采用PLS-DA(Partial Least Squares Discrimination Analysis)分析方法进行组间代谢物差异性比较，然后经T检验结合多元分析OPLS-DA方法筛选差异代谢物，通过KEGG数据库进行通路注释，再通过MetPA方法分析差异代谢物对通路的影响，最后采用Spearman相关性分析肠道差异菌群与粪便差异代谢物之间的联系。

2 结 果

2.1组间代谢物差异性 通过PLS-DA得分图上样品分布点的远近判断样品中所含有的变量或分子的组成和浓度的接近程度，显示模型组各样本距离与空白组之间分开较远，说明IBS-D肝郁脾虚证大鼠粪便代谢物发生了变化；痛泻要方组及匹维溴铵组与模型组各样本间比较亦有一定距离，说明痛泻要方及匹维溴铵对IBS-D肝郁脾虚证大鼠粪便中代谢物产生了影响。见图1。

图1 空白组与腹泻型肠易激综合征肝郁脾虚证各组大鼠粪便中内源性代谢产物PLS-DA得分图

2.2差异代谢物分析 组间差异代谢物筛选(同时满足VIP>1，P<0.05)显示，模型组与空白组中差异代谢物共47种，其中26种上调，21种下调，见图2；痛泻要方组与模型组中差异代谢物共31种，其中10种上调，21种下调，见图3；匹维溴铵组与模型组差异代谢物共25种，其中21种上调，4种下调，见图4。对比发现，有8种物质既在模型组与空白组中存在差异，也在痛泻要方组中存在差异，其中Gamma-Tocotrienol、Porrigenin、Deoxycholic、Amasterol、25-Acetylvulgaroside、Tonantzitlolone在模型组中异常高表达，痛泻要方组下调；Carboxyifosfamide和Ustiloxin在模型组中低表达，痛泻要方组上调。此外，Urobilinogen(尿胆素原)、Pregnan-20-one(孕多糖-20-1)和Hydroxyhomodestruxin(羟基同去丝裂霉素)同时在模型组和匹维溴铵组中存在差异，其中Pregnan-20-one和Hydroxyhomodestruxin在模型组中高表达，匹维溴铵组下调；Urobilinogen在模型组中低表达，匹维溴铵组上调。

图2 空白组与腹泻型肠易激综合征肝郁脾虚证模型组大鼠粪便中差异代谢物火山图

图3 痛泻要方组与模型组腹泻型肠易激综合征肝郁脾虚证大鼠粪便中差异代谢物火山图

图4 匹维溴铵组与模型组腹泻型肠易激综合征肝郁脾虚证大鼠粪便中差异代谢物火山图

2.3差异代谢物KEGG通路富集分析 模型组与空白组差异代谢物富集通路共47条，其中属于Metabolism 31条、Environmental Information Processing 3条、Genetic Information Processing 1条、Human Diseases 5条、Organismal Systems 7条，富集率差异有统计学意义的共19条，其中Central carbon metabolism in cancer(癌症中的中枢碳代谢)和Glycine, serine and threonine metabolism(甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢)有极显著差异(P均<0.001)，见图5；痛泻要方组与模型组差异代谢物富集通路共13条，属于Metabolism 11条、Organismal Systems 2条，其中Purine metabolism(嘌呤代谢)、Cholesterol metabolism(胆固醇代谢)、Caffeine metabolism(咖啡因代谢)、Arginine biosynthesis(精氨酸生物合成)和Vitamin B6metabolism(维生素B6代谢)富集率差异均有统计学意义(P均<0.05)，见图6；匹维溴铵组与模型组差异代谢物富集通路共10条，属于Metabolism 8条、Organismal Systems 2条，其中Cholesterol metabolism(胆固醇代谢)、Primary bile acid biosynthesis(初级胆汁酸生物合成)富集率有极显著差异(P均<0.001)，Caffeine metabolism(咖啡因代谢)、Taurine and hypotaurine metabolism(牛磺酸和低牛磺酸代谢)、Secondary bile acid biosynthesis(次生胆汁酸生物合成)和alpha-Linolenic acid metabolism(α-亚麻酸代谢)富集率差异均有统计学意义(P均<0.05)，见图7。

图5 空白组与腹泻型肠易激综合征肝郁脾虚证模型组大鼠粪便中差异代谢物KEGG通路富集分析图

图7 匹维溴铵组与模型组腹泻型肠易激综合征肝郁脾虚证大鼠粪便中差异代谢物KEGG通路富集分析图

2.4差异代谢物对通路的影响分析 MetPA分析并绘制KEGG通路拓扑气泡图显示，对模型组和空白组影响相对较大的是Glycine,serine and threonine metabolism(甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢)，其次是Aminoacyl-tRNA biosynthesis(氨基酰基-tRNA生物合成)、Glyoxylate and dicarboxylate metabolism(乙醛酸和二羧酸代谢)、Methane metabolism(甲烷代谢)及Citrate cycle(柠檬酸循环)；对痛泻要方组与模型组影响相对较大的是Purine metabolism(嘌呤代谢)，其次是Caffeine metabolism(咖啡因代谢)、Vitamin B6metabolism(维生素B6代谢)、Arginine biosynthesis(精氨酸生物合成)和Primary bile acid biosynthesis(初级胆汁酸生物合成)；对匹维溴铵组与模型组影响相对较大的是Primary bile acid biosynthesis(初级胆汁酸生物合成)，其次是Caffeine metabolism(咖啡因代谢)、Taurine and hypotaurine metabolism(牛磺酸和次牛磺酸代谢)、Arachidonic acid metabolism(花生四烯酸代谢)和Purine metabolism(嘌呤代谢)。见图8。

图中每个气泡表示1个KEGG通路，横轴表示代谢物在通路中的相对重要性的大小，气泡越大表示重要性越大；纵轴表示代谢物参与通路的富集显著性，颜色代表通路富集的P值图8 空白组与腹泻型肠易激综合征肝郁脾虚证各组大鼠粪便中内源性代谢产物KEGG 拓扑学分析气泡图

3 讨 论

本研究筛选出模型组与空白组中差异代谢物共47种，痛泻要方组与模型组中差异代谢物共31种，匹维溴铵组与模型组差异代谢物共25种。其中Deoxycholic acid、Gamma-Tocotrienol、Carboxyifosfamide、25-Acetylvulgaroside等8种代谢物在模型组与空白组中存在差异，且经痛泻要方干预后明显改善。Deoxycholic acid是次级胆汁酸中的一种，可以促进脂肪分解，然而有研究表明过高浓度的Deoxycholic acid可以增加结肠黏膜的通透性[11]。本研究发现，Deoxycholic acid在上述8种差异代谢物中丰度最高，与空白组相比，模型组上调1.18倍；经痛泻要方干预后下降0.43倍，且接近空白组，说明痛泻要方对Deoxycholic acid具有较好的调节作用。王劲松等[12]研究显示，Deoxycholic acid灌胃可以诱导大鼠短暂轻微的结肠炎症和持续稳定的内脏痛觉过敏，并且增加了脊髓背根神经节上c-fos mRNA的表达，因此认为Deoxycholic acid可能在某些IBS的痛觉过敏中发生作用。Gamma-Tocotrienol为维生素E家族成员，是一种天然的抗氧化剂，其可通过加速间充质免疫细胞的恢复、阻止肠通黏膜透性增加发挥保护放射治疗小鼠肠道的作用[13]。

通过差异代谢物KEGG通路富集分析，发现模型组与空白组富集的通路有47条，说明IBS-D的形成机制较为复杂，且主要与Metabolism(代谢)有关。痛泻要方组与模型组富集的通路主要有13条，匹维溴铵组与模型组富集的通路主要有10条。其中痛泻要方组与模型组、匹维溴铵组与模型组共有的通路6条，分别是Cholesterol metabolism、Primary bile acid biosynthesis、Caffeine metabolism、Secondary bile acid biosynthesis、Purine metabolism及Bile secretion(胆汁分泌)，说明痛泻要方与匹维溴铵治疗IBS-D机制不完全相同，痛泻要方组涉及通路更多，作用更全面。如痛泻要方在Arginine biosynthesis和Tryptophan metabolism方面有优势，而匹维溴铵组不涉及。Arginine biosynthesis对应的代谢物质是Citrulline，Tryptophan metabolism对应的物质是N’-Formylkynurenine。模型组中Citrulline、N’-Formylkynurenine含量较空白组明显升高，经痛泻要方干预后两者含量均下调，特别是N’-Formylkynurenine含量变化更明显，说明痛泻要方对IBS-D大鼠粪便中N’-Formylkynurenine代谢紊乱具有较好的调节作用。因此，痛泻要方治疗IBS-D的作用机制之一可能是调节N’-Formylkynurenine含量，进而影响色氨酸代谢通路。色氨酸是一种人体必需的氨基酸，N’-Formylkynurenine是其代谢物之一，其另一个重要的代谢产物就是5-羟色胺(5-HT)，5-HT与IBS-D内脏高敏感相关。如裘世轲等[14]报道IBS-D肝郁脾虚证大鼠血清中5-HT含量明显高于正常大鼠，于丰彦等[15]研究发现IBS-D患者直肠初始感觉阈值、排便阈值、疼痛阈值和肛门直肠收缩压与5-HT相关，说明色氨酸代谢通路与IBS-D内脏高敏感相关。故推断痛泻要方可以通过调节色氨酸代谢通路降低内脏高敏感。

本研究MetPA分析显示，模型组与空白组L-丝氨酸、L-色氨酸、肌酸对甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路影响最大，痛泻要方组与模型组次黄嘌呤、黄嘌呤对嘌呤代谢通路影响最大，匹维溴铵组与模型组胆甾-5-烯-3β,26-二醇及牛磺胆酸对初级胆汁酸生物合成通路影响最大。嘌呤代谢通路与IBS的关系研究目前相对较少，2020年美国梅奥诊所的一项研究[16]首次将次黄嘌呤与IBS发病机制联系起来，研究发现IBS-D中粪便次黄嘌呤的含量显著降低，这与微生物对次黄嘌呤的降解有关，认为嘌呤代谢的宿主-微生物途径可能在IBS的病理生理中起重要作用，低水平的嘌呤核苷酸可能导致较低的上皮能量状态和黏膜修复能力，这可能是IBS的病理生理基础之一，因此他们认为次黄嘌呤是有吸引力的药物靶标。本研究发现IBS-D大鼠粪便中次中黄嘌呤、黄嘌呤水平升高，经痛泻要方干预后水平明显下调，这与上述研究结果不一致，说明嘌呤代谢途径在IBS-D发病机制中的作用尚需更多的研究证实。

综上所述，痛泻要方对IBS-D肝郁脾虚型大鼠的作用可能是通过调节脱氧胆酸、γ-生育三烯醇、羧异环磷酰胺、25-乙酰基葡萄糖苷、次黄嘌呤、黄嘌呤等代谢物质水平，影响精氨酸生物合成、色氨酸代谢、次级胆汁酸生物合成、泛醌和其他萜类醌生物合成、胆汁分泌、嘌呤代谢等相关代谢途径实现的，但尚需进一步实验加以验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。