缬草三酯的提纯、成型工艺及其含量测定研究进展

＊曹井龙 薛慧 李艳楠 刘健 侯考爽 金成浩

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院 黑龙江 163319）

前言

蜘蛛香（Valeriana Jatamansi Jones）又名马蹄香、小马蹄香、臭药、雷公七等，是败酱科、缬草属植物。蜘蛛香为多年生草本植物，具有理气止痛、祛风除湿以及镇惊安神等功效。蜘蛛香在我国有悠久的药用历史，其产量丰富，主要分布在我国西南地区[1]。蜘蛛香主要含有挥发油、环烯醚萜类和生物碱类等有效成分，2010年《中国药典》中收录蜘蛛香为中国传统中药，其一直被用于治疗神经系统类疾病，如焦虑、失眠和抑郁等[2]。研究表明，从蜘蛛香环烯醚萜类成分中分离得到的缬草三酯具有良好的抗肿瘤活性，其相关作用机制和化合物的质量标准受到了广大学者的关注[3]。在蜘蛛香的制备工艺中，当代新工艺提取纯化技术，提高了中药提取物的纯度、收率，并降低了能耗、试剂用量。制剂工艺技术的提高，使提取物的物理化学性质更加稳定，且生物利用度和存储时间得到了提高与延长。综上所述，缬草三酯的提取纯化、成型工艺及药理活性研究对其生产和进一步的药物开发具有重要意义。

1.缬草三酯的提取纯化工艺

随着当代工业技术的发展和研究的不断深入，研究人员已可从天然药物中逐渐提取出多种单体成分，并对其在药物开发和作用机制方面进行不断探索和阐释[4]。现代高新提取技术与传统的水煎煮、渗透、浸渍和水蒸气蒸馏等提取方法相比，大大提高了提取效率和限度。寻找一种高效的方法将天然药物的有效成分进行提取纯化已成为重点关注内容。

缬草三酯为黄色油状物，其密度与沸点分别为1.22g/cm3、525.9℃，易溶于甲醇、乙醇、DMSO等有机溶剂。在缬草三酯的提取研究中，罗喜荣等人[5]利用超临界CO2萃取法将蜘蛛香粉末置于超临界萃取器，提取产物溶解于甲醇溶液，并以甲醇做空白对照在256nm处测定其吸光值，最终通过响应曲面法得到不同提取工艺条件，其最佳萃取压力、温度和时间分别为30MPa、43.69℃、47.07min。该方法具有萃取高效、无溶剂残留和步骤简单等优点。郜红利等人[6]利用超声辅助提取法将蜘蛛香粉末与乙醇混合后进行超声提取，利用紫外分光光度法，将缬草三酯对照品与甲醇混合，依据不同浓度标准品的吸光值绘制标准计算曲线，计算提取物的质量浓度，并用Plackett-Burman试验联合星点设计效应面法得到不同提取工艺条件，其最佳乙醇体积分数、浸泡时间和超声时间分别为65%、3h、30min，最终平均收率为4.37%。该方法具有重复性可靠和保持提取产物性质稳定的优点。李广雷等人[7]通过石油醚渗漉法将蜘蛛香粗粉与石油醚混合进行萃取，萃取液回压浓缩后进行硅胶柱层析和洗脱，利用薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）法检测提取物浓度，采用色谱方法和制备液相色谱法进行分离，其制备液相色谱最优流动相比、进样量和流速分别为甲醇-水（80:20）、1.0mL、20mL/min，最终得到98%纯度的缬草三酯提取物。李广雷等人通过硅胶的初步分离和液相色谱法纯化使有机溶剂的用量大大减少，同时也减少硅胶对提取物的吸附。浦绍敬等人[8]通过超临界萃取法将蜘蛛香切片粉碎后加入到萃取器中，调节萃取温度和CO2流量，经过一级、二级和三级分离罐的连续萃取得到产物，将产物进行HPLC法纯度分析和核磁共振波普仪结构分析，最终得到最佳萃取温度、CO2流量和萃取时间分别为50～55℃、38～40kg/h、2h。该方法具有分离效果良好、提取效率增加及产物损耗减少等优点。付洋等人[9]通过超声提取法将蜘蛛香粉末与乙醇混合进行超声提取，产物进行微孔滤膜过滤，利用高效液相色谱法测定样品含量，采用响应面法与熵权法绘制回归方程得到不同提取条件，其最佳乙醇浓度、料液比和提取时间分别为50%～90%、35～65mL/g、20～40min。最终将响应面法与熵权法结合使蜘蛛香中的有效成分得到最大限度提取。综上所述，超临界CO2萃取法可有效避免缬草三酯在提取过程中的挥发，更有益于提取产物的稳定，但因其试剂用量较大，不适合于大规模生产。

2.缬草三酯的成型工艺

成型工艺（Moulding process）是根据半成品的物理化学性质与医疗要求，将其制成能直接供临床应用制剂的工艺过程。尽管天然药物的提取纯化技术已得到高度重视，但对其提取物的相关物理特性了解相对较少。大多数天然药物提取物会出现一些问题，例如：易吸湿、易挥发、易热不稳定等，同时部分提取物会出现刺激性气味。如何改善提取物的不良物理性能和掩盖其刺激性气味，对天然药物的现代化发展至关重要[10]。

在缬草三酯的成型工艺中，鲁文琴等人[11]利用固体自微乳法将提取后的缬草三酯与油酸乙酯、15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯（HS）和二乙二醇单乙基醚（Transcutol P）混合搅拌均匀，经过超声处理后加入吸附剂（α-乳糖或β-环糊精）混合得到缬草三酯自微乳产物，并通过吸附能力检测、休止角和卡尔指数等研究测定产物理化性质，最终得到最佳自微乳与β环糊精比例为1:5.714。该成型工艺技术使提取物口服利用度得到提高，但该制剂的稳定性易受到高温及光照等因素的影响，应低温避光保存。刘开萍等人[12]将油酸乙酯、油相、乳化剂和助乳化剂混合，通过溶解度检测和配伍试验测定得到缬草三酯、油相、乳化剂和助乳化剂之间的最佳试剂配比，再将产物经过高速离心、强光照射和温度变化等方法检测该处方的稳定性，最终最佳配伍试剂中油酸乙酯、15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯（HS）和二乙二醇单乙基醚（Transcutol P）的最佳比例分别为10%～30%、40%～80%、10%～53%。以上数据显示，自微乳法可有效解决缬草三酯的水敏感性和难溶性问题，提高口服利用度和肠溶度，为自微乳在难溶性药物中的应用提供了实验依据。

3.缬草三酯的含量测定

中药单体成分的含量测定作为质量控制指标之一，为中药的应用提供数据支持和质量保障。由于中药的成分过于复杂，且可能存在多种性质相似的同系物。随着研究的不断深入，已发展出多种精准的测定方法，但每种测定方法都存在相应的局限性，目前应用较多的测定方法为色谱法和分光光度法[13]。气相色谱法可通过汽化测定样品使其进入色谱柱，利用分子间作用力和流出时间不同进行样品测定与分离。该方法具有高灵敏、高效率和高选择等优点，但受其检测原理的限制，只能测定具有挥发成分的样品。而高效液相色谱法是通过液压差将测定样品进入色谱柱，利用各组分极性的不同进行样品测定与分离。该方法具有高分辨、高灵敏和高重复等优点，但其分析成本较高，且价格及其维护费用昂贵。紫外-分光光度法通过利用相同物质的吸光值相同的特点，对测定样品与标准品的吸光值进行比较分析。该方法具有高速率的优点，但其检测需要大量标准单品，且易受多种因素影响导致检测结果不准确。为确保有效成分测定的高效和精准，需要根据不同的理化性质选用相应测定方法。

在缬草三酯的含量测定研究中，罗喜荣等人[14]通过分光光度法测定蜘蛛香中不同部位的缬草三酯含量，将蜘蛛香不同部位进行粉碎处理，用乙酸乙酯浸泡后进行超声萃取并过滤，取缬草三酯标准品与待测样品溶液在256nm波长处进行吸光度测定，绘制回归方程计算出不同样品的含量。结果表明，在蜘蛛香的不同部位中缬草三酯的含量存在显著差异，在提高蜘蛛香的利用率方面，应以其根及根茎入药为最佳。黄仁泉等人[15]通过高效液相色谱法测定不同种缬草的缬草三酯含量，将不同种缬草的根进行粉碎处理，甲醇溶液浸泡后进行超声萃取并过滤，取样品上清液与对照品进行色谱仪测定，绘制标准曲线计算出不同样品的含量。结果表明，东北缬草和心叶缬草中缬草三酯的含量最高。因此为了提高提取产量，可优先考虑以东北缬草和心叶缬草作为主要提取原料。袁秀芝等人[16]通过紫外-分光光度法测定不同产地缬草的缬草三酯含量，将不同产地的缬草进行粉碎处理，苯溶液浸泡后进行超声萃取，取产物样品与标准品分别溶于苯溶液进行吸光值测定，绘制回归方程得出样品含量。结果表明，湖北和贵州地区的缬草中缬草三酯含量最高。因此在缬草的用药质量方面，可以考虑选择湖北与贵州产地的缬草。崔亚君等人[17]通过双波长薄层扫描法测定四川省不同种缬草的缬草三酯含量，将不同种缬草进行粉碎处理，用二氯甲烷浸泡后进行石油醚萃取，提取产物与苯溶液混合进行硅胶层析分离与薄层分离，将产物进行核磁共振氢谱检测，绘制标准曲线计算样品含量。结果表明，在四川省红原地区的全叶缬草与石棉地区的蜘蛛香中缬草三酯的含量最高，为选取缬草三酯的提取原料提供了数据参考。以上研究方法可精准、高效地测定缬草三酯含量，为其质量标准测定方法的改良与优化提供依据。

4.展望

随着现代工业技术的发展，缬草三酯的提取效率与质量大幅提高，尽管目前对其提取纯化技术的研究比较完善，但对于其成型工艺的研究却相对缺乏，如果只是片面地追求缬草三酯的产物纯度，有可能会导致产物的疗效降低，还可能导致其副作用的增加，因为在提取纯化过程中会出现溶剂残留、刺激性气味及性质改变等特殊问题。因此，优化缬草三酯提纯工艺技术的同时，也要注重缬草三酯成型工艺的技术研究，在了解其理化性质的基础上，减少其毒副作用和特殊问题的发生。此外，含量测定方法的改良与优化是提高产品纯度与保障产品质量的先决条件，因此应不断探索和改善缬草三酯的含量测定方法，为其日后开发与应用提供理论参考。