水产品中己烯雌酚残留检测方法

金丽琼，张 睿，刘 妤，杨 静

（甘肃省分析测试中心，兰州 730000）

随着中国经济的快速发展，以及人们生活水平的日益提高，水产养殖业得到了快速发展。食品质量安全问题备受关注，特别是水产品中药物残留问题成为人们关注的重点，虽然国家食品安全标准已经对水产品饲料添加剂的使用做出了严格规定，但是大量使用违禁药物的现象依然存在［1］。己烯雌酚是一种人工合成的非甾体雌激素类药物，在水产品养殖过程中，将其添加在养殖饲料中可以很好地促进水产品的生长，从而有效缩短养殖时间［2］。同时己烯雌酚已经被研究者证实在水产品养殖过程中存在严重的残留问题［3］，这种残留会对人类和环境造成严重危害。国内外研究发现，己烯雌酚可以破坏机体的遗传物质，导致基因突变，引发肿瘤［4］。由于己烯雌酚等激素药物在水产养殖中的滥用，对水产品中己烯雌酚等激素药物的残留监测已经引起了全世界的高度重视。欧盟已经在食用性动物饲养中将其列为禁用品，2002年中国农业部发布的《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》（农业部公告第176号）中也禁止在畜禽水产养殖过程中使用己烯雌酚［5］。农业行业标准NY∕T 842—2021《绿色食品鱼》中要求己烯雌酚不得检出［6］。由此可以看出，己烯雌酚严重威胁着人们的食品安全，需要严格禁止其在水产品养殖过程中使用［7］，因此，分析水产品中己烯雌酚残留检测方法具有重要的意义。

1 己烯雌酚简介

己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES），化学名为（E）-4，4′-（1，2-二乙基-1，2-亚乙烯基）双苯酚，分子量268.35，分子式为C18H20O2，CAS：6898-97-1，沸点为（407.1±25.0）℃，结构式见图1。己烯雌酚是一种人工合成的非甾体雌激素药物，为无色结晶或白色结晶性粉末，难溶于水，易溶于醇及脂肪油。

图1 己烯雌酚

2 己烯雌酚的检测方法

水产品中己烯雌酚的检测方法主要有酶联免疫法、气相色谱-质谱法和高效液相色谱-质谱法等。现将近10年报道的相关检测方法分别进行分析综述，分析现有检测方法的优点和缺点，以及需要改进的技术难点。

2.1 酶联免疫法

农业部1163号公告—1—2009《动物性食品中己烯雌酚残留检测酶联免疫吸附测定法》中规定了标准的适用范围是猪肉、猪肝、虾样本中己烯雌酚残留量的检测，该标准是一种快速筛选阳性样品的检测方法，如果出现阳性样品时，还需要用仪器进行再次确认。该标准的方法原理是采用间接竞争ELISA方法，首先在微孔条上包被偶联抗原，样品中如果存在己烯雌酚，己烯雌酚就会与偶联抗原竞争酶标板上的己烯雌酚抗体的结合位点结合，结合成功的己烯雌酚酶标记物可以将显色剂显色，显色后的样品通过酶标仪测定吸光度（450 nm 波长），吸光度与己烯雌酚含量形成负相关，通过与标准曲线比较后，就可以计算出己烯雌酚残留的含量［8］。方法检出限为2 μg∕kg，本方法在3～12 μg∕kg 添加浓度水平上回收率为60%～110%。该标准方法具有操作简单、实际使用量少、适合大批量检测任务的优点。

行业标准SC∕T 3020—2004适用于水产品肌肉中己烯雌酚的检测，该标准的方法原理与农业部1163号公告—1—2009相同，方法检出限为0.6 μg∕kg，回收率≥70%［9］。该标准方法灵敏度有所提高，但是样品前处理过程需要用C18固相萃取小柱纯化，前处理过程繁琐。张瑞凌等［10］对现有标准中采用酶联免疫法检测己烯雌酚的方法进行了优化，样品用乙腈提取，中性氧化铝小柱净化，用己烯雌酚ELISA 试剂盒检测，简化了前处理过程，方法检出限为0.35 μg∕kg，加标回收率为77%～91%，可以满足检测要求，并采用液相色谱-质谱联用法验证了结果。

2.2 气相色谱-质谱法

农业部1163号公告—9—2009 标准适用于水产品中可食部分中己烯雌酚残留量的测定［11］。该标准的方法是用乙酸乙酯提取样品中的药物残留，通过SLH 固相萃取小柱净化样品，再用硅烷化试剂进行衍生化后，用气相色谱-质谱仪测定，外标法定量。 方法检出限为0.5 μg∕kg，本方法添加浓度为0.5～10.0 μg∕kg 时，回收率≥70%。己烯雌酚沸点为407 ℃，已经超出了色谱柱的最高温度325 ℃，因此，需要将己烯雌酚衍生成沸点较低的硅烷化衍生物进行检测，该标准前处理过程复杂。尹怡等［12］在此基础上分别建立了基质固相分散法、固相萃取法与气相色谱-质谱联用测定水产品中己烯雌酚残留量的分析方法，其中基质固相分散法回收率大于90%，检出限为0.3 μg∕kg；固相萃取法回收率大于80%，检出限为0.5 μg∕kg；并比较了2 种前处理方法，发现基质固相分散法更简便、省时、经济环保。朱金兰等［13］简化了采用气相色谱-串联质谱法测定水产品中己烯雌酚含量时的前处理过程，样品直接用乙腈、正己烷和乙酸乙酯提取，不需要通过固相小柱萃取，直接经BSTFA-TMCS 吡啶溶液在50 ℃衍生后，上机测定；该方法的定量限为0.5 μg∕kg，检测限为0.1 μg∕kg。马丽莎等［2］建立了QuEchERs∕Gc-Ms 法测定鱼、虾中雌二醇和己烯雌酚（DES）的残留情况，该方法的平均回收率为86.1%～115.0%，检出限（LOD，S∕N≥3）为0.3 μg∕kg；QuEchERs 处理方法与固相萃取法比较，缩短了前处理时间，减少了试剂的使用量，检测过程经济环保。

2.3 高效液相色谱-质谱法

国家标准GB∕T 22963—2008 适用于多种水产品中激素类药物残留的测定，该标准的方法检出限为1.0 μg∕kg，方法回收率≥80%［14］。该标准方法适用范围限制了液相色谱-串联质谱法在水产品中己烯雌酚残留量的检测使用。李向军等［15］建立了采用高效液相色谱串联质谱法同时测定水产品中24种性激素的方法，样品用乙酸乙酯提取2 次，硅胶柱净化后，可同时测定24 种激素，其中己烯雌酚的定量限为1.0 μg∕kg，回收率大于80%。李佩佩等［16］建立了采用凝胶渗透色谱和固相萃取小柱净化样品后，用高效液相色谱法测定水产品中药物残留的分析方法，其中己烯雌酚的回收率大于80%，定量限为5.0 μg∕kg。王宏亮等［17］建立了配备有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪，同时对虾中雌三醇、雌二醇、己烯雌酚等8 种雌激素进行鉴别和含量测定的方法，样品经超声提取，滤膜过滤，待测上机，该方法样品前处理过程简单，减少了化学试剂的使用，适合大批量检测任务，并可以同时完成8 种激素的检测，其中己烯雌酚的回收率大于90%，定量限为0.09 μg∕mL。王丹华等［18］采用高效液相色谱仪实现了同时测定水产品中15 种激素残留的检测方法，样品经超声提取，滤膜过滤，直接用高效液相色谱分析，其中己烯雌酚的回收率大于90%，定量限为0.09 mg∕kg，该方法实现了检测水产品中的多种激素残留，前处理过程简单，灵敏度高。杨帆等［19］采用超高效液相色谱串联质谱法测定水产品及其制品中3 种抗生素和14种性激素的残留量，样品经乙酸乙酯提取后，过GCB∕NH2固相萃取柱净化，待测，其中己烯雌酚的回收率大于60%，定量限为3 μg∕kg。

2.4 其他方法

在酶联免疫、气相色谱仪串联质谱和液相色谱仪串联质谱检测己烯雌酚的基础上，卢安根等［20］提出了将荧光素酶报告基因检测技术应用到水产品中己烯雌酚含量的测定，常用的检测方法检出限高，通常只能检测一种激素的含量，该方法虽然前处理过程复杂，检测成本较高，但是具有灵敏度高、可以同时检测多种激素含量的优点，其中己烯雌酚的加标浓度为1.0×10-3μg∕kg 时，回收率为75%。吕杨等［21］将电致化学发光方法应用到水产品中己烯雌酚含量的测定，电致化学发光具有灵敏度高、重现性好、检测设备简单、适合大批量样品检测等优点，试验结果表明，线性范围为1～50 pg∕mL 时，线性相关系数为0.993，电致化学发光免疫传感平台的检测限为1 pg∕mL，可以满足己烯雌酚残留量测定的行业标准。随着分子印迹技术的快速发展，因其具有特异性识别的特点，也被应用到己烯雌酚的检测技术中。何雨等［22］将分子印迹技术和新型荧光碳纳米粒子技术应用到己烯雌酚的检测方法中，在0.02～7.45 mg∕L 浓度内，方法检出限为0.059 μg∕L，回收率在81.7%～110.3%，相对标准偏差小于10.7%。结果表明，该方法制备的己烯雌酚荧光印迹聚合物可以满足己烯雌酚残留量的检测。

3 小结

目前可以参考的水产品中己烯雌酚的标准测定方法中，酶联免疫法只适合快速筛选检测，可疑样品仍然需要用仪器进行确认。由于己烯雌酚的沸点较高，采用气相色谱-质谱法检测时，需要将己烯雌酚进行衍生后再检测，存在前处理过程复杂的问题。高效液相色谱-质谱法灵敏度低，但方法检出限高。因此，本研究通过解析现有标准方法存在的问题，综述近10年报道的相关水产品中己烯雌酚检测方法的研究进展，以期为建立前处理方法简单、检测效率高的己烯雌酚检测方法提供一定的研究依据，为水产业绿色发展奠定基础。