铁皮石斛主要成分及其含量检测方法的研究

冯柳娟，刘凯月，全海倩

（深圳市深业航天食品与环境检测科技有限公司，广东深圳 518040）

铁皮石斛长期以来作为中药材应用，2020年国家卫健委发布通知将铁皮石斛列为药食同源管理。研究表明，铁皮石斛中含有多糖、生物碱、氨基酸、挥发性成分、微量元素等成分，主要的活性物质是多糖类化合物，具有生津养阴的作用[1]。多糖具有抗氧化、清除自由基、保护心肌细胞的作用。铁皮石斛多糖能显著提高外周白细胞数，促进淋巴细胞产生移动抑制因子，可有效提高机体免疫力[2]。醇溶性浸出物中包含了生物碱等物质，生物碱是抗肿瘤的重要成分。甘露糖为铁皮石斛多糖水解后的主要单糖，可以提高人体免疫力[3]。以铁皮石斛作为研究对象，对其主要成分及其含量检测方法进行分析，进一步了解铁皮石斛的价值。

1 材料和方法

1.1 仪器

Ultimate 3000 型液相色谱仪，Thermo fisher 公司产品；UV-1800PC 型紫外分光光度计，上海翱艺科学仪器有限公司产品；GZX-DH202-1-BS 型电热恒温干燥箱，上海捷呈实验仪器有限公司产品；SX2-4-10TP 型箱式电阻炉、HWS24 型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司产品；H2050R 型离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；FA1104 型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品。

1.2 材料

索式提取器；葡萄糖标准品≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司提供；100 %甘露糖标准品，中检所提供；盐酸氨基葡萄糖（CNW）；1- 苯基- 3 - 甲基- 5 - 吡唑啉酮（分析纯）；甲醇（色谱纯）；氢氧化钠（分析纯）；盐酸（优级纯）；三氯甲烷（分析纯）；乙醇（优级纯）；苯酚（分析纯）；浓硫酸（分析纯）；乙腈（色谱纯）；乙酸铵（优级纯），铁皮石斛，深圳市农科集团研究院提供。

2 方法和结果

2.1 铁皮石斛样品的处理

将鲜条于90 ℃条件下杀青8 h，粉碎后过三号筛（50 目），同时测定粉碎后的水分含量。将干品直接粉碎后过三号筛（50 目），同时测定其水分含量。计算醇溶性浸出物、多糖、甘露糖含量（需按干燥品计）。将全部铁皮石斛样品粉碎过筛，以保证样品的均匀性、代表性及结果的准确性。

2.2 水分、灰分、醇溶性浸出物含量及其检测方法

《中国药典》2020年版中铁皮石斛水分的测定采用干燥失重法，灰分采用灼烧法，醇溶性浸出物采用热浸法，并规定水分不得超过12.0%，总灰分不得超过6.0%，醇溶性浸出物不得少于6.5%[4]。该项目对多批次铁皮石斛的水分、灰分、醇溶性浸出物进行测定，测定水分和灰分前的称量瓶或坩埚连续2 次称重的差异不超过0.3 mg，醇溶性浸出物最好直接采购95%的乙醇作为提取溶液，自行配制的乙醇会影响试验结果，提取温度80 ℃左右，提取时冷凝回流管与锥形瓶连接处要避免冷凝水蒸汽滴入锥形瓶中，否则影响试验结果。结果表明，市售干燥铁皮石斛的水分含量为8.0%～12.0%，灰分含量为3%～4%，铁皮石斛鲜条水分为80%左右，总灰分含量0.9%左右，醇溶性浸出物含量为4.0%～12.0%。

铁皮石斛鲜条和干品水分、灰分含量见表1，醇溶性浸出物含量结果见图1。

表1 铁皮石斛鲜条和干品水分、灰分含量/%

图1 醇溶性浸出物含量结果

2.3 铁皮石斛多糖含量及其检测方法

多糖含量是评判铁皮石斛的品质优劣的重要指标之一，铁皮石斛多糖的提取方法有热水浸提法、酸提取法、碱提取法、有机溶剂提取法、酶提取法等，常通过微波或超声辅助。该项目石斛多糖的测定采用苯酚硫酸法，利用强酸将用热水提取出来的多糖水解成单糖（包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖等），再与显色物质反应，测其吸光度即可测得多糖的含量，颜色越深，多糖含量越高[5]。称干燥试样约0.3 g，加水200 mL，100 ℃水浴冷凝回流2 h，冷却后定容至250 mL，过滤，取滤液2 mL 于离心管中，加入无水乙醇10 mL，摇匀后冷藏1 h，取出恢复室温后以转速8 000 r/min 离心20 min，能达到较好的离心效果，弃去上清液，为了结果更加准确，同一提取液可吸取2～3 个样液进行沉淀离心，保证结果的精密度，沉淀加入体积分数为80%的乙醇洗涤离心2 次，不溶物用热水溶解后定容至25 mL。取待测液1 mL 与具塞刻度试管中，加入质量分数为5%的苯酚溶液1 mL，再加入浓硫酸5 mL，沸水浴中加热20 min，冰浴中冷却5 min，于紫外波长488 nm处测定吸光度，同时测定标准工作溶液。《中国药典》2020年版中规定多糖不得少于25.0%[4]，试验结果表明不同年限的石斛的多糖含量有差异，含量在20%～60%。

多糖含量结果见图2。

图2 多糖含量结果

2.4 铁皮石斛甘露糖含量、甘露糖和葡萄糖峰面积比及其检测方法

目前，测定甘露糖的主要方法有高效液相色谱法。该项目采用索氏提取法提取甘露糖，高效液相色谱仪上机。因《药典》中直接将提取后的滤纸筒加水煎煮容易导致溶液爆沸飞溅，试验采用滤纸包裹样品，经索氏提取后将样品用水转移至烧杯中进行煎煮，可减少搅拌的时间及防止爆沸；用三氯甲烷洗涤，可直接采用涡旋振荡，静置后弃去下层溶液，反复3 次，直至上层溶液清澈透明。

仪器条件：进样量10 μL；色谱柱C18（150×4.6 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；流动相为乙腈- 0.02 mol/L 的乙酸铵溶液（20∶80）；二极管阵列检测器，检测波长250 nm。根据甘露糖、葡萄糖标准品的保留时间定性，内标法定量。在上述色谱条件下，出峰顺序依次为PMP、甘露糖、盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖，甘露糖的保留时间为16.280 min。

HPLC 色谱图见图3。

图3 HPLC 色谱图

《中国药典》2020年版中规定甘露糖含量为13.0%～38.0%，甘露糖和葡萄糖峰面积比范围为2.4～8.0[4]。试验结果表明，甘露糖含量为10.0%～30.0%，甘露糖和葡萄糖峰面积比为1.0～5.0。

甘露糖含量结果见图4，甘露糖和葡萄糖峰面积比结果见图5。

图4 甘露糖含量结果

图5 甘露糖和葡萄糖峰面积比结果

3 结论

试验最后对12 批次的铁皮石斛的醇溶性浸出物含量、多糖含量、甘露糖含量、甘露糖含量与葡萄糖峰面积比进行分析，结果显示醇溶性浸出物含量高其多糖含量不一定低，多糖含量高其甘露糖含量不一定高，这与铁皮石斛的种植环境、采收时间及种植年限等有关。

铁皮石斛醇溶性浸出物含量、多糖含量、甘露糖含量、甘露糖含量与葡萄糖峰面积比见表2。

表2 铁皮石斛醇溶性浸出物含量、多糖含量、甘露糖含量、甘露糖含量与葡萄糖峰面积比

近年来，铁皮石斛种植越来越广，但不同的生产条件对其品质有重要的影响，结合铁皮石斛的多批次的检测结果，总结铁皮石斛检测过程中注意的要点，试验结果可为铁皮石斛的产品品质评价提供参考依据。