NtCPS2 基因对烟草腺毛发育及其分泌物合成的影响

韩文龙，郑 聪，曹可心，张路阳，徐晓雯，谢 可，祖琼瑶，徐世晓

（1.河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002；2.福建南平烟草公司，福建 南平 353000；3.河南省烟草公司许昌市公司，河南 许昌 461000）

烟草（Nicotiana tomentosiformisL.）腺毛是存在于烟草叶片上的一种特殊的多细胞结构，能够合成和分泌烟草重要的香气物质，对烟草的抗逆性和质量具有非常重要的作用[1]。烟草叶片的腺毛包括长柄腺毛、短柄腺毛以及保护毛[2]。其中，长柄腺毛和短柄腺毛合成烟草重要的致香物质西柏三烯二醇[3]。研究表明，烟草腺毛密度与烟草叶片中α-和β-西柏三烯二醇的含量呈正相关[4]。因此，通过调控烟草腺毛发育有助于提高和改善烟叶香气。

烟草腺毛的发育受多个基因调控，WANG 等[5]研究发现，敲除烟草NtCycB2（Cyclin B2）基因促进烟草长柄腺毛的形成，过表达NtCycB2基因抑制烟草长柄腺毛的生成；刘一华[6]研究发现，NtGIS（Glabeous inflorescence stems）基因过表达株系腺毛密度高于野生型（Wild type，WT），NtGIS基因干扰株系腺毛密度显著低于WT；崔丽鹏[7]研究发现，NtJAZ3（Jasmonate-zim-domain protein 3）基因负调控烟草多细胞腺毛的发育。另外，烟草腺毛的发育也受植物激素的调控[8-12]。娄亚楠等[10]和冯琦等[11]研究发现，外施茉莉酸甲酯可以提高烟草叶片腺毛密度；贺凌霄等[12]研究发现，外施赤霉素（GA3）可以提高烟草叶片腺毛的长度和密度。

NtCPS2基因是赖柏当类物质顺-冷杉醇（Cisabieion）的关键合成基因，在烟草腺毛中特异性表达[13]。贺凌霄等[14]研究发现，NtCPS2基因编辑后代GA3合成相关基因表达量提高，GA3含量增加。顺-冷杉醇和GA3都是烟草重要的二萜类物质[15]，两者的代谢途径存在共同的合成底物香叶基香叶基焦磷 酸（Geranylgeranyl-PP，GGPP）[16]。目 前，关 于NtCPS2基因的研究多集中于其对顺-冷杉醇合成途径的影响方面，而NtCPS2基因与烟草腺毛发育及其分泌物合成的关系尚不明确。为此，以编辑NtCPS2基因的8306 纯合编辑系（KD）和WT 为材料[17]，分别将KD 与WT 放置在正常生长条件下以及外施GA3和矮壮素处理的生长条件下，比较KD 和WT的叶片腺毛密度、西柏三烯二醇含量、GA3含量以及相关调控基因表达量的差异，以期明确NtCPS2基因对烟草腺毛发育及西柏三烯二醇合成的影响，为调控烟草腺毛发育和香气物质的合成提供新思路。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为烟草8306 野生型WT 和纯合编辑系KD。其中，KD 是在分析8306NtCPS2基因CDS（编码区序列）和基因组序列的基础上，在第2 外显子区域设计了2 个gRNA 靶位点序列，构建RNA 载体，经过农杆菌介导的遗传转化得到的在靶位点上成功发生突变[17]的第二代纯合编辑系。

1.2 试验设计

选用饱满的8306 WT 和KD 种子，用1%KMnO4溶液浸泡消毒30 min 后，用蒸馏水洗净烟草种子表面的KMnO4溶液并播种于方形培养皿中，待种子发芽后移栽至装满基质（pH 值5.5～7.0、腐植酸含量≥5.0%、有机质含量≥25.0%）的黑色方形培养盆（高10 cm、直径8 cm）中。然后放入28 ℃恒温光照培养箱（12 h 光照/12 h 黑暗、湿度60%）中培养，待烟苗四叶一心时分别喷施0.025 mmol/L GA3及矮壮素（A），对照（CK）喷施蒸馏水。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 腺毛形态和密度 在喷施后30 d 时，各处理均选取3 株长势均匀的烟株，取生长状态相近的中部叶片3 片，用2 g/L 罗丹明B 溶液进行染色处理，染色后用VHX-600V 超景深显微镜（日本基恩士公司）观察烟草叶片腺毛形态，并统计腺毛密度，每个叶片统计3个视野的腺毛密度。

1.3.2 西柏三烯二醇和顺-冷杉醇含量 在喷施后20 d时，各处理均选取5株长势均匀的烟株，取中间部位叶片5 片，保证叶片面积一致，去除叶片主脉，置于500 mL 的二氯甲烷溶液中进行浸提。收集浸提液后加入内标物质（1 mL正-17-烷醇），用旋转蒸发仪蒸发浓缩至50 mL 后进行衍生化反应，用GCMS 检测法进行分析并定性，最后根据内标物质含量进行西柏三烯二醇和顺-冷杉醇含量的定量分析。

1.3.3 GA3含量 在喷施后20 d 时，各处理均选取长势均匀的WT和KD中间部位叶片混样0.5 g，迅速用液氮冷冻后，放置于-80 ℃超低温冰箱中保存待测，随后采用间接酶联免疫吸附法（ELISA）[18]进行GA3含量测定。

1.3.4 GGPP 含量 在喷施后20 d 时，各处理均选取长势均匀的WT和KD中间部位叶片混样0.5 g，迅速用液氮冷冻后，放置于-80 ℃超低温冰箱中保存，随后采用间接酶联免疫吸附法（ELISA）[18]进行GGPP含量测定。

1.3.5 基因表达量 在喷施后20 d 时，各处理均选取长势均匀的WT和KD中间部位叶片混样0.1 g，采用总RNA 提取试剂盒（索莱宝生物公司）提取样品叶片中总RNA，放置于-80 ℃超低温冰箱中保存。利用PCR 仪将待测RNA 逆转录成cDNA，储存在-20 ℃冰箱中备用。

对赤霉素合成基因CPS（Ent-copalyl diphosphate synthase）、GA20ox（GA20-oxidase），顺-冷杉醇合成基因NtCPS2，GGPP 合成基因DXR（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase），西柏三烯二醇合成基因CYC（Cembratrien-ol synthetase）、CYP71D16，腺毛负调控基因NtCycB2进行表达量分析，引物序列（表1）采用Roche LCPDS2软件设计，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）扩增采用诺唯赞生物公司的TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix。20 μL 体系：2×TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 0.4 μL，水8.8 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.4 μL。qRT-PCR 程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃10 s、60 ℃30 s，40 个循环。采用2-ΔΔCt法对基因表达量进行计算。

表1 荧光定量PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers for fluorescence quantitative PCR

1.4 数据处理与分析

试验数据采用Excel 2016 软件进行计算和作图，使用SPSS 20.0统计软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理WT和KD中顺-冷杉醇含量及其关键合成基因NtCPS2表达量分析

由图1 可知，在CK 组中KD 顺-冷杉醇含量及NtCPS2基因相对表达量均显著低于WT，说明在编辑NtCPS2基因后顺-冷杉醇含量显著降低。外施GA3后，WT的顺-冷杉醇含量和NtCPS2基因相对表达量均显著降低；外施矮壮素后，KD 和WT的顺-冷杉醇含量和NtCPS2基因相对表达量总体上均显著升高。说明GA3代谢途径和顺-冷杉醇生物合成之间存在一定的联系。

图1 不同处理KD和WT中顺-冷杉醇含量（A）及其关键合成基因NtCPS2相对表达量（B）Fig.1 The content of cis-abieion（A）and relative expression level of its key synthetic gene NtCPS2（B）in KD and WT under different treatments

2.2 不同处理WT和KD中GA3含量及其关键合成基因表达量分析

由图2A 可知，对于CK，与WT 相比，KD 中GA3含量升高25%；外施GA3后，KD 和WT 中GA3含量均显著增加，平均升高50%；外施矮壮素后，KD 和WT中GA3含量均显著降低，平均降低25%。由图2B—C可知，对于CK，KD中GA3关键合成基因CPS、GA20ox相对表达量均显著高于WT；外施GA3后，KD 和WT 中GA3关键合成基因CPS、GA20ox相对表达量均显著升高；外施矮壮素后，KD 和WT 中GA3关键合成基因CPS、GA20ox相对表达量均显著降低。整体上KD升高和下降的幅度大于WT。

2.3 不同处理WT和KD叶面腺毛形态和密度及其关键合成基因表达量分析

由图3A—B 可知，对于CK，KD 的叶片腺毛密度和长度均高于WT，平均升高28%，说明编辑NtCPS2基因后烟草叶片腺毛密度和长度增加；外施GA3后，KD 和WT 腺毛密度均显著增加，平均增加50%；外施矮壮素后，KD 和WT 腺毛密度均显著减少，平均减少56%。说明内源GA3含量的变化影响烟草叶片腺毛发育。图3C 表明，对于CK，编辑NtCPS2基因后KD 的NtCycB2基因相对表达量显著低于WT；外施GA3后，KD 和WT 的NtCycB2基因相对表达量均显著下降，KD 下降幅度大于WT；外施矮壮素后，KD 和WT 的NtCycB2基因相对表达量均显著升高，KD 升高幅度大于WT。此结果与叶片腺毛密度变化结果基本一致。

图3 不同处理KD和WT叶片腺毛形态（A）、密度（B）及其负调控基因NtCycB2相对表达量（C）Fig.3 The morphology（A）and number（B）of glandular hairs and the relative expression level of its negative regulator gene NtCycB2（C）in KD and WT under different treatments

2.4 不同处理WT和KD叶片腺毛西柏三烯二醇含量及其合成基因的表达量分析

图4A 表明，对于CK，KD 的叶片腺毛西柏三烯二醇含量高于WT，提高约25%，说明编辑NtCPS2基因提高了烟草叶片腺毛西柏三烯二醇分泌物含量；外施GA3后，KD 和WT 西柏三烯二醇含量均显著增加，平均增加50%；外施矮壮素后，KD 和WT 西柏三烯二醇含量均显著减少，平均减少46%。说明内源GA3含量的变化不仅影响烟草叶片腺毛发育，而且提高了烟草叶片西柏三烯二醇的分泌量。图4B—C 表明，对于CK，编辑NtCPS2基因后KD 的CYC和CYP71D16基因相对表达量均高于WT；外施GA3后，KD 和WT 的CYC和CYP71D16基因相对表达量均显著升高；外施矮壮素后，KD 和WT 的CYC和CYP71D16基因相对表达量均显著降低。整体上KD 升高和下降的幅度大于WT，这与西柏三烯二醇含量变化结果一致。

图4 不同处理WT和KD西柏三烯二醇含量（A）及其合成基因CYC（B）和CYP71D16（C）相对表达量Fig.4 The content of cembranoids（A）and relative expression level of its synthetic genes CYC（B）and CYP71D16（C）in WT and KD under different treatments

2.5 不同处理WT和KD中GGPP含量及其关键合成基因DXR表达量分析

由图5 可知，对于CK，KD 的GGPP 含量以及其关键合成基因DXR相对表达量均高于WT；外施GA3后，KD 和WT 的GGPP 含量和DXR基因相对表达量均显著升高；外施矮壮素后，KD 和WT的GGPP含量以及DXR基因相对表达量均显著下降。KD 的GGPP 含量以及DXR基因相对表达量升高或降低的幅度大于WT。

图5 不同处理WT和KD的GGPP含量（A）及其关键合成基因DXR相对表达量（B）Fig.5 GGPP content（A）and relative expression level of its key synthetic gene DXR（B）in WT and KD under different treatments

3 结论与讨论

本研究结果表明，与WT 相比，KD 的内源GA3含量升高。GA3和顺-冷杉醇生物合成途径存在共同底物GGPP，GGPP 在CPS 合酶的催化下参与GA3生物合成途径[19]，在CPS2 合酶的催化下参与顺-冷杉醇合成途径[20]。NtCPS2基因编码CPS2，在编辑NtCPS2基因后，NtCPS2基因表达量下降，CPS2 活性降低，一方面减少了CPS2 对底物GGPP 的竞争，另一方面顺-冷杉醇合成途径受阻，间接导致底物GGPP 含量升高，更多的GGPP 参与GA3生物合成途径，内源GA3含量升高，这与贺凌霄等[14]的研究结果一致。

本研究结果表明，与WT 相比，KD 叶片腺毛密度增加，叶片腺毛分泌物西柏三烯二醇含量增加，同时KD 内源GA3含量升高，推测编辑NtCPS2基因影响了内源GA3的生物合成，进而影响了烟草腺毛的发育。因此，对KD 和WT 外施GA3和矮壮素，结果表明，与CK 相比，外施GA3后，KD 和WT 的内源GA3含量显著增加，叶片腺毛密度显著增加，NtCycB2基因表达量显著降低；外施矮壮素后，KD和WT 的内源GA3含量降低，叶片腺毛密度减少，NtCycB2基因表达量显著升高。说明内源GA3含量是影响烟草腺毛发育的因素之一。研究表明，GA3对拟南芥腺毛的生长和发育有重要的作用[21]。周忠静[22]研究发现，GA3的合成和运输对拟南芥腺毛的发育具有重要的调控作用。GA3信号传导影响腺毛生长相关关键基因的启动，研究表明，GL1（Glabrous 1）和TTG（Transparent testa glabra）基因是调控腺毛发育的2 个关键基因，其中GL1 蛋白序列与受GA3调 控 的 Myb（V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）家族转录因子同源，TTG基因对腺毛发育的调控作用可被与GA 信号传导有关的R（R1R2R3）基因所代替[23-26]，烟草腺毛的发育调控机制与拟南芥存在一定的相似性，本研究发现，NtCPS2基因通过调控内源GA3的生物合成和信号转导进而影响烟草腺毛发育。刘一华[6]的研究结果表明，在烟草中外施GA3导致烟草叶片腺毛密度显著增加，而用VIGS 技术干扰GA3生物合成基因GA20ox后，干扰材料内源GA3含量降低，叶片腺毛密度显著降低，这与本研究结果一致。WANG 等[5]研究发现，烟草NtCycB2基因负调控烟草腺毛发育，过表达NtCycB2基因，烟草叶片腺毛密度降低，沉默NtCycB2基因，烟草叶片腺毛密度升高，这与本研究结果一致。

本研究发现，与WT 相比，KD 叶片腺毛分泌物西柏三烯二醇含量显著升高。西柏三烯二醇是烟草重要的香气物质，其主要由烟草叶片腺毛合成和分泌，一方面KD 叶片腺毛密度增加，西柏三烯二醇含量升高；另一方面，编辑NtCPS2基因后，西柏三烯二醇关键合成基因CYC、CYP71D16表达量升高，西柏三烯二醇含量增加。研究发现，烟叶表面腺毛密度与叶片腺毛分泌物含量呈正相关[27]。烟株内GA3含量升高，有助于烟草叶片腺毛分泌物西柏三烯醇的积累[28]。外施GA3提高了烟草叶片腺毛密度，外施矮壮素减少了叶片腺毛的密度[12]。此外，GA3也是二帖类化合物的一种[29]，其与西柏三烯二醇具有共同底物GGPP，外施GA3提高了烟株内源GA3含量，进而节省了底物GGPP 在GA3合成途径中的消耗，提高了GGPP 含量，进而提高了西柏三烯二醇合成关键基因CYC、CYP71D16的表达量，西柏三烯二醇含量增加。外施矮壮素则降低了内源GA3含量，植物为了维持内源GA3的平衡，更多的GGPP 参与GA3合成，增加了GGPP 的消耗，进而抑制了西柏三烯二醇关键合成基因CYC、CYP71D16的表达，西柏三烯二醇含量减少[30-31]。

本研究发现，编辑NtCPS2基因后KD 内源GA3含量升高，叶片腺毛密度增加，西柏三烯二醇含量升高。此结果与外施GA3处理相同，与外施矮壮素处理相反。表明编辑烟草NtCPS2基因影响了烟草内源GA3的生物合成进而影响了烟草叶片腺毛的发育及其分泌物的合成，初步揭示了NtCPS2基因在烟草萜类代谢和腺毛发育中的作用。