山茱萸环烯醚萜苷对延缓大鼠脑动脉瘤进展的影响

马 宁,董晓辉,刘彦青,刘博峰

保定市第二医院神经外科 ,保定 071051

脑动脉瘤(cerebral aneurysm, CA)是严重危害人类健康的脑血管疾病,发病率高达1%～5%[1]。CA是引发自发性蛛网膜下腔出血的直接原因,意外事件发生风险仅次于高血压、脑血栓[2]。山茱萸环烯醚萜苷(cornus officinalis iridoid glycosides, CLG)是从山茱萸中提取的有效成分之一,具有补肾益肝、抗炎降糖、抗氧化和神经保护等药理作用,在中医临床中被广泛应用[3]。研究发现,CLG可用于心脑血管疾病的治疗,具有抗瘤、抗癌等作用[4]。本研究旨在通过建立CA大鼠模型,探讨CLG是否通过Ras同源基因家族蛋白(Rho)/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶(ROCK)信号通路延缓CA大鼠瘤样的发展,为CLG药物研发及CA临床治疗提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

荧光定量PCR仪(美国Bio-rad公司);全波长酶标仪(法国巴德斯公司);旋转蒸发仪(RE-2000A, 上海荣亚生化仪器厂)。

1.2 试药

山茱萸环烯醚萜苷(批号071207,首都医科大学宣武医院药物研究室);肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α, TNFα)、白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA试剂盒均购自南京建成生物有限公司;实时荧光定量PCR试剂盒(美国ABI公司);兔抗β-actin多克隆抗体、兔抗大鼠Rho多克隆抗体、兔抗大鼠Rock2多克隆抗体均购自美国CST公司;山羊抗兔二抗IgG(北京博尔迈生物技术有限公司);ECL化学发光试剂(美国Bio-rad公司)。

1.3 实验动物

65只7～8周龄SPF级雄性SD大鼠,体质量200～250 g。动物来源于北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号为SCXK(京)2016-0011。所有大鼠在相同饲养环境适应性饲养7 d,环境温度为22 ℃～24 ℃,相对湿度为50%～60%,环境光暗周期各12 h,适应期间可自由进食和饮水。研究过程中对动物的处置符合动物委员会的准则。

2 方法

2.1 CA大鼠模型建立

65只7～8周龄SPF级雄性SD大鼠,随机选取50只大鼠建立CA模型[5],腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(40 mg·kg-1),开腹后分离出双侧肾动脉后支,丝线予以结扎,再分离左侧颈总动脉进行结扎,缝合消毒,待大鼠苏醒,分组观察。术后7 d内用50 g·L-1氯化钠溶液代替饮水,若大鼠同时出现轻偏瘫(大鼠行动迟缓,运动对称性差、单侧前肢伸展较弱)和动眼神经麻痹(眼球向单侧方向斜视、眼球转动受限),颅内压和体温升高为建模成功大鼠(48只)[6]。

2.2 分组与给药

建模7 d后,造模成功CA大鼠随机分为模型组(12只)、CLG低剂量组(12只)、CLG中剂量组(12只)及CLG高剂量组(12只),未手术大鼠为对照组(12只)。参照文献[7-8]用量,CLG低剂量、中剂量及高剂量组灌胃给药100、150、200 mg·kg-1CLG溶液(蒸馏水配制),对照组和模型组给予等量蒸馏水。各组给药1天1次,连续30 d。

2.3 样本采集

给药期间,根据容量压力记录法测量各组大鼠尾动脉收缩压、舒张压和平均动脉压,平均动脉压=(收缩压+2×舒张压)/3,3 d测量1次血压,计算术后各组大鼠血压均值。末次给药后,禁食24 h,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血。血液静置4 h,以3 000 r·min-1(r=12 cm)高速离心15 min,分离血清,-80 ℃保存。采血结束,生理盐水灌注大鼠心脏30 min,处死,脑主动脉血管取材,切取一小块脑组织于4 g·mL-1多聚甲醛液中固定24 h备用,剩余脑组织-80 ℃保存备用。

2.4 炎性因子检测

取分离好的血清,按酶联免疫吸附法试剂盒的双抗体夹心方法测定血清中TNF-α、IL-1和IL-6的含量。将样品加入空白孔,稀释样品后封闭,覆膜孵育30 min。加入工作液100 μL于各孔,吹打混匀后置于37 ℃孵育60 min,终止反应,酶标仪波长设为630 nm,测定其吸光度值(A值)。以对照品A值为纵坐标、样品质量浓度为横坐标,建立标准曲线,代入待测样品计算样本质量浓度。

2.5 HE染色观察

将脑组织经过甲醛固定24 h后,流水冲洗4 h,不同梯度乙醇浸泡,用无水乙醇和二甲苯透明,石蜡浸泡,将组织包埋于石蜡中切成5 μm厚度的切片,无水乙醇和二甲苯浸泡脱蜡,PBS缓冲液漂洗,苏木素染液中染色10 min,氨水反蓝20 min,伊红染色8 min,不同梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。阴凉处晾干后,将脑动脉组织切片置于光学显微镜下观察并拍片。

2.6 Rho、Rock2 mRNA表达

取出保存的动脉组织,按照RNA提取试剂盒说明书操作,提取总RNA,将RNA逆转录为cDNA后保存备用,配制PCR反应体系20 μL,TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL,Anchored Oligo(dT)18(0.5 μg·μL-1)1 μL,2×TS Reaction Mix 10 μL,总RNA1 μg,ddH2O 7 μL。引物序列分别为Rho:上游5′-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3′,下游5′-TGCT-TCTCTCCCCAGGAATA-3′;Rock2:上游5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′,下游5′-TCCACCACCCTGTTGCT-3′;β-actin:上游5′-CCTCGTCCCGTAGACAAATG-3′,下游5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTGT-3′。反应条件为按照94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,采集信号40个循环,剔除误差数据,相对表达量以2-△△CT计算,所有样本独立重复实验3次。

2.7 Rho、Rock2蛋白表达

取备用的各组大鼠脑组织适量,制备裂解液。细胞总蛋白提取试剂5 mL、蛋白酶抑制剂50 μL,与组织匀浆至充分裂解。低温离心,按照BCA Protein Assay Kit检测样品蛋白质量浓度。取样品蛋白40 μg,SDS-PAGE进行凝胶电泳,恒压75 V下浓缩胶电泳40 min,恒压120 V电泳20 min,至溴酚蓝及Marker位置提示电泳已到位即停止。转至PVDF膜,TBST100 mL稀释5 g脱脂奶粉,摇床封闭2 h,再加入1∶2 000稀释一抗,封口,4 ℃过夜,TBST清洗3次,加入1∶2 000稀释标记二抗,室温下孵育2 h,TBST清洗4次,滴加适量ECL发光试剂工作液,静置2 min。凝胶分析系统采集图像,用Image J对获得的图像进行分析。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 血压测量结果

与对照组比较,模型组收缩压、舒张压和平均动脉压升高(P<0.05)。与模型组比较,CLG 3组大鼠3组数值均降低(P<0.05)。与CLG低剂量组比较,CLG中剂量、高剂量组血压值降低(P<0.05)。与CLG中剂量组比较,CLG高剂量组血压值降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血压比较

3.2 炎性因子水平比较

与对照组比较,模型组大鼠血清TNF-α、IL-1和IL-6水平升高(P<0.05)。与模型组比较,3组大鼠3项水平降低(P<0.05)。与CLG低剂量组比较,CLG中、高剂量组3项水平降低(P<0.05)。与CLG中剂量组比较,CLG高剂量组3项水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组炎症因子水平比较

3.3 HE染色结果

对照组大鼠动脉壁外膜光滑,弹力层形态正常,内皮细胞排列紧密,弹性纤维组织形态正常。模型组大鼠脑动脉壁出现外膜增厚、内弹力垫变薄、纤维细胞增生等现象,且动脉壁呈瘤样扩张。CLG低剂量、中剂量及高剂量组大鼠动脉壁均呈现病变程度减轻、内皮细胞受损情况好转、少量纤维细胞增生,动脉壁的瘤样扩张在一定程度上得到改善。见图1。

注:A.对照组;B.模型组;C.CLG低剂量组;D.CLG中剂量组;E.CLG高剂量组。

3.4 Rho、Rock2 mRNA水平

与对照组比较,模型组大鼠脑组织中Rho、Rock2 mRNA表达水平升高(P<0.05)。与模型组比较,3组大鼠2项水平降低(P<0.05)。与CLG低剂量组比较,CLG中剂量、高剂量组大鼠2项水平降低(P<0.05)。与CLG中剂量组比较,CLG高剂量组大鼠2项水平降低(P>0.05)。见表3。

表3 各组脑组织Rho、Rock2 mRNA水平比较

3.5 Rho、Rock2蛋白水平比较

与对照组比较,模型组大鼠脑组织中Rho、Rock2蛋白表达水平升高(P<0.05)。与模型组比较,3组大鼠2项水平降低(P<0.05)。与CLG低剂量组比较,CLG中剂量、高剂量组大鼠2项水平降低(P<0.05)。与CLG中剂量组比较,CLG高剂量组大鼠2项水平降低(P>0.05)。见图2、表4。

注:A.对照组;B.模型组;C.CLG低剂量组;D.CLG中剂量组;E.CLG高剂量组。

表4 各组脑组织Rho、Rock2蛋白水平比较

4 讨论

CA的形成与发展是颅内动脉管壁发生了局部缺损出现的血管性病变,由于动脉管壁局限性扩张造成了血管瘤变突起所致,多发生于脑底动脉环分叉位置和主要分支位置[9]。CLG提取自山茱萸,山茱萸为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉,环烯醚萜苷类为其特征性成分[10]。研究发现,CLG对多种肿瘤均有抑制作用,将CLG用于小鼠成纤维细胞、人肺癌细胞、人结肠癌细胞及人白血病细胞的培养实验,通过细胞增殖比较其作用,发现CLG可抑制肿瘤细胞生长[11]。且CA大鼠模型具有诱导简单、可重复性强、构建周期短、损耗成本低及模型稳定等优势[12]。故本研究建立CA大鼠模型,从分子机制上探讨CLG对CA动脉瘤进展的抑制作用,探究其作用机制。结果显示,模型组大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压、TNF-α、IL-1及IL-6升高,在给予CLG干预下均表现出收缩压、舒张压、平均动脉压、TNF-α、IL-1及IL-6降低,可见CLG在一定程度上能改善CA大鼠的血压水平异常,减轻炎症反应。观察脑动脉组织病理切片发现,模型组大鼠脑动脉壁出现外膜增厚,内弹力垫变薄,纤维细胞增生等现象,且动脉壁呈瘤样扩张。与模型组比较,给予高剂量CLG能够显著减轻内皮细胞受损、纤维细胞增生的现象,且有抑制动脉壁瘤样扩张的作用。

Rho/Rock信号通路在细胞水平广泛参与细胞肌动蛋白骨架调节,还与血管紧张素、内皮素-1及血小板源性生长因子等多种血管活性物质相互作用,从而影响细胞增殖、分化、凋亡及基因表达等[13]。在分子水平可上调多种细胞因子,与促进炎症、氧化应激、血栓形成及纤维化等病理现象密切相关[14]。Rho蛋白是Ras家族的小G蛋白分子,会促进肿瘤细胞生长[15]。Rock是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,作为下游效应器,与肌动蛋白骨架重组、细胞生长和凋亡及基因转录等多种重要生理过程息息相关。Rock作为神经损伤修复过程中的关键酶,其影响机制是通过先使肌动蛋白磷酸化失活,再抑制神经突触的敏感性[16]。本研究中,模型组大鼠脑动脉组织Rho、Rock2 mRNA和蛋白表达均升高,而给予CLG干预后Rho、Rock2 mRNA和蛋白表达均明显降低,可见CLG可能通过抑制Rho/Rock信号通路,发挥协调炎症反应,抑制动脉瘤样扩张的作用。

综上所述,CLG能够改善CA大鼠血压水平异常,调节血清炎性因子水平,抑制动脉瘤样扩张,可能是通过调节大鼠Rho/Rock信号通路发挥抑制肿瘤的作用,可其为临床治疗CA提供实验依据。