唑来膦酸脂质体的制备及抗肿瘤活性研究

景莎莎,梁 宇,郭洁芬,胡海洋

1.西安国际医学中心医院,西安 710100;2.深圳市博德维环境技术股份有限公司西安分公司,西安 710000;3.西安万隆制药股份有限公司,西安 710119;4.沈阳药科大学,本溪 117004

乳腺癌是导致女性肿瘤相关死亡的主要原因之一,世界卫生组织2020年的数据显示,乳腺癌已经取代肺癌,成为全球第一大癌症[1],乳腺癌的治疗得到了广泛的关注与研究。

唑来膦酸(zoledronic acid,ZOL)是一种含氮杂环双磷酸盐,水溶性强,可抑制骨吸收[2],临床用于治疗恶性肿瘤性高钙血症[3]。研究发现,唑来膦酸不仅可以缓解乳腺癌骨转移骨痛[4-5],还可以通过阻断肿瘤微环境在发病机制中的支持作用来抑制乳腺癌的发展[6],延长总生存期[7],而且唑来膦酸和内分泌治疗药物联合应用可以增强对人乳腺癌细胞的抑制作用[8-9],但静脉注射大剂量唑来膦酸溶液会产生一定的肾毒性[10-11]。

脂质体具有良好的生物相容性,毒性低,被广泛地应用于癌症的治疗中[12],抗癌药物脂质体利用EPR效应到达肿瘤组织[13],提高药效并减少全身不良反应[14]。包封率(encapsulation efficiency,EE)和载药量(drug loading,DL)的高低直接决定药物的疗效[15],水溶性药物易泄漏,包封率低[16],故提高包封率尤为重要。Box-Behnken效应面法近年来已广泛应用于制剂的优化[17-18],适用于多因素多水平实验设计,评价因素与指标间的非线性关系,具有预测性好、精度高的优点。现拟将单一药物唑来膦酸用逆向蒸发法[19]制备成脂质体,并通过Box-Behnken效应面法对包封率、载药量进行优化[20-21],验证用最佳处方制备的唑来膦酸脂质体(zoledronic acid liposomes,ZOL-LIPs)在体液(pH7.4)中的稳定性,研究唑来膦酸脂质体对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用,探索一种有效的乳腺癌治疗方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

日立L-2000系列高效液相色谱仪、TGL-16C型台式离心机均购自日本Hitachi公司;RE52CS型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);KYC-100B型恒温培养摇床(上海福玛实验设备有限公司);马尔文激光粒度仪(美国DT公司);TECAN SPECTRA多功能酶标仪(德国Wetzlar公司);细胞培养超净工作台(上海龙跃仪器设备制造有限公司);MM-1型微量振荡器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试药

唑来膦酸一水合物(质量分数98.0%,南京康满林化工实业有限公司);蛋黄卵磷脂、胆固醇均购自上海艾韦特医药科技有限公司;甲基噻唑蓝(methylthiazole blue,MTT)、胰酶、DMSO均购自美国Sigma公司;高糖DMEM培养基(美国HyClone公司);96孔细胞培养板(无锡耐思生物科技有限公司);乙腈(色谱纯,山东禹王化工有限公司);磷酸(色谱纯,天津市康科德科技有限公司);超滤离心管(默克密理博公司);Triton X-100(国药集团化学试剂有限公司);透析袋(相对分子质量14 000,美国联合碳化物公司);四丁基氢氧化铵(质量分数10%,天津市科密欧化学试剂有限公司);焦磷酸钠(天津市永大化学试剂有限公司)。

1.3 细胞

人乳腺癌细胞株MCF-7购自北京北纳创联生物技术研究院。

2 方法与结果

2.1 唑来膦酸脂质体及空白脂质体的制备

2.1.1唑来膦酸脂质体(ZOL-LIPs)的制备 将适量磷脂、胆固醇置于圆底烧瓶中,用氯仿溶解,旋蒸除去氯仿形成一层薄膜,再用乙醚溶解,加入适量唑来膦酸的PBS水溶液,水浴超声20 min,再旋蒸除去乙醚后,得到乳白色凝胶,加入适量PBS溶液,50 ℃孵育30 min,即得ZOL-LIPs混悬液。

2.1.2空白脂质体(BLANK-LIPs)的制备 制备方法同唑来膦酸脂质体,用适量PBS水溶液代替唑来膦酸的PBS水溶液即可。

2.2 唑来膦酸体外分析方法的建立

2.2.1色谱分析条件与标准曲线 色谱柱为Kromasil C18(200 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈-缓冲液(含质量浓度为177.68 mg·L-1的焦磷酸钠、149.97 mL质量浓度为100.0 mg·L-1的四丁基氢氧化铵,调pH至6.9)=17∶83;流速为1 mL·min-1;检测波长为209 nm;进样量为20 μL。标准曲线为A=11 619C-41 294(R2=0.999 4),唑来膦酸质量浓度在5.00～100.00 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.2包封率测定 采用超滤离心法[22]测定唑来膦酸的包封率,精密量取ZOL-LIPs混悬液0.5 mL,置于10 mL量瓶中,加入适量质量浓度为100.0 mg·L-1的Triton X-100破乳,定容,按照2.2.1项下的条件进样测定并记录峰面积,计算总药量W1;另取ZOL-LIPs混悬液0.5 mL置于超滤离心管中,以5 000 r·min-1离心30 min,测定并记录峰面积,计算外管中游离药物量W2。包封率(EE)=[(W1-W2)/W1]×100%。

2.3 Box-Behnken实验设计

2.3.1因素和水平设计 包封率和载药量是评价ZOL-LIPs质量的重要指标,选择对脂质体包封率影响显著的3个因素,即药物与磷脂的质量比(A)、磷脂与胆固醇的质量比(B)、乙醚与PBS的体积比(C),各设计3个水平,以包封率(y1,EE)和载药量(y2,DL)为评价指标,采用Box-Behnken实验设计进行优化。因素水平见表1,设计与结果见表2。

表1 Box-Behnken实验设计中的变量

2.3.2二次回归模型的建立 利用Box-Behnken软件对表2中的数据进行回归分析,得到二次回归模型:EE(%)=43.76-3.76A+1.54B-0.50C+1.10AB-0.73AC+0.38BC-10.36A2-6.86B2-3.33C2(R2=0.971 9);DL(%)=2.10+0.71A+0.41B-0.025C+0.27AB-0.050AC+0.050BC-0.54A2-0.49B2-0.26C2(R2=0.989 8)。回归方程系数显著性检验结果见表3。

表2 实验设计及结果

2.3.3方差分析和显著性检验 结果见表3。2个拟合方程的相关系数表明模型的拟合程度良好,由表3中的回归系数显著性检验P值可知,模型1中的A(P=0.000 9)]、A2(P<0.000 1)、B2(P=0.000 2)、C2(P=0.009 5)极显著,其他项不显著,且失拟差(Lack ofFit)(P=0.105 8)也不显著;模型2中的A(P<0.000 1)、B(P<0.000 1)、AB(P=0.001 7)、A2(P<0.000 1)、B2(P<0.000 1)、C2(P=0.001 9)极显著,其他项不显著,且失拟差(Lack of Fit)(P=0.090 1)也不显著。表明可利用该模型对ZOL-LIPs处方的包封率和载药量进行分析和预测,且因素A的影响最大,其次依次为B、C。

表3 回归方程中系数的显著性检验

2.3.4效应面优化与验证 应用Design Expert软件,绘制各指标与3个自变量的三维曲面图。结果见图1和图2。图1和图2可以直观地反映各因素的交互作用对响应值的影响,并得到优化后的处方(A=0.067、B=5.503、C=1.941)。图中响应面曲线和等高线说明响应值(包封率和载药量)受到3个因素间交互作用的影响较显著,这与方差分析的结果一致。

图1 药物与磷脂质量比(A)、磷脂与胆固醇质量比(B)、乙醚与PBS体积比(C)对包封率(y1)影响的效应面图

图2 药物与磷脂质量比(A)、磷脂与胆固醇质量比(B)、乙醚与PBS体积比(C)对载药量(y2)影响的效应面图

按优化后的处方平行进行3次实验,实验观察值与模型预测值接近,表明该模型可准确预测包封率、载药量,其实验值和预测值见表4。

表4 模型验证实验的预测值和实测值

2.3.5ZOL-LIPs表征 用激光粒度仪测定脂质体的粒径、多分散性及Zeta电位,用透射电镜观察脂质体的微观形态[23-24]。

取用最优处方制备的ZOL-LIPs混悬液适量,稀释,用0.22 μm微孔滤膜过滤后,用马尔文激光粒度仪对ZOL-LIPs混悬液的粒径与Zeta电位平行测定3次,结果见图3。由图3可见,ZOL-LIPs的平均粒径为(197.3±1.7) nm,PDI为(0.170±0.027),Zeta电位为(-21.4±0.34) mV。

注:A.ZOL-LIPs混悬液的粒径分布;B.ZOL-LIPs混悬液的Zeta电位。

取ZOL-LIPs混悬液适量,取稀释10倍的样品10 μL滴在覆有支持膜的铜网上,静置5 min后用滤纸吸干,再滴加适量质量浓度为10.0 mg·L-1的磷钨酸溶液于铜网上染色5 min,置于透射电镜下观察,结果见图4。由图4可见,ZOL-LIPs呈球状或类球状,粒径为170～220 nm。

图4 ZOL-LIPs混悬液的透射电镜图

2.3.6稳定性考察 通过测定脂质体在4 ℃存放时的渗漏率来评价脂质体的稳定性[25]。取ZOL-LIPs混悬液适量,测定其在4 ℃存放1、2、3、5、7、10、15 d的渗漏率(LR%),结果见图5。由图5可见,ZOL-LIPs在15 d内,包载的唑来膦酸的渗漏率在15%以下,符合稳定性要求。

图5 ZOL-LIPs混悬液在4 ℃放置15 d的渗漏率曲线 (n=3)

2.3.7体外释放研究 利用透析法[26-27]研究ZOL水溶液与ZOL-LIPs混悬液的体外释放行为。分别精密量取ZOL水溶液与ZOL-LIPs混悬液置于透析袋中,置于装有PBS缓冲液的50 mL锥形瓶中,37 ℃下恒温振荡。分别于0.5、l、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h吸取1 mL释放介质,同时补加等体积空白介质,测定ZOL的释放量,ZOL的累积释放度见图6。由图6可见,ZOL-LIPs混悬液中ZOL的释放速度比ZOL水溶液中的ZOL释放速度更慢,表明脂质体具有一定的缓释作用,且ZOL-LIPS中的ZOL在48 h内的释放量能达到80%以上。

图6 ZOL-LIPs混悬液和ZOL水溶液的体外释放曲线 (n=3)

2.3.8体外细胞毒性评价 用MTT测定法评估ZOL原料药、BLANK-LIPs及ZOL-LIPs的体外细胞毒性[28]。分别用无血清高糖DMEM培养液稀释ZOL水溶液、BLANK-LIPs混悬液和ZOL-LIPs混悬液,配制成质量浓度分别为1.45、2.90、5.80、8.70、14.50、29.00、58.00、145.00 μg·mL-1的系列ZOL水溶液及ZOL-LIPs混悬液。将MCF-7细胞以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中,在体积分数5% CO2、37 ℃培养12 h,于每孔中加入200 μL各系列质量浓度的ZOL水溶液、BLANK-LIPs及ZOL-LIPs,各质量浓度设置3个复孔,继续培养48 h,加入20 μL MTT溶液,培养4 h,弃去混合溶液,各孔中加入150 μL DMSO溶液溶解,在微量振荡器上振荡10 min使结晶紫充分溶解,测定490 nm处的吸光度值,计算细胞存活率和IC50值,结果见图7。

由图7可见,ZOL水溶液、BLANK-LIPs对MCF-7细胞的抑制作用较小,而ZOL-LIPs对MCF-7细胞具有一定的抑制作用,其IC50值为110.55 μg·mL-1。

图7 不同质量浓度的ZOL水溶液、BLANK-LIPs和ZOL-LIPs混悬液对MCF-7细胞的毒性 (n=3)

3 讨论

研究发现,影响ZOL-LIPs包封率最主要的因素为药物与磷脂的质量比(P=0.000 9),呈负相关。分析是由于磷脂质量相对于药物增加时,形成的脂质体数量增多,且粒径增大,包封于脂质体中的内水相体积增大,能包载更多药物,因而包封率提高。当药物量相同时,若磷脂量过多,形成的ZOL-LIPs容易聚集融合,导致药物泄漏;若磷脂量过少,形成的ZOL-LIPs的数量减少,内水相的体积减小,则包封率随之降低。

影响ZOL-LIPs载药量最主要的因素为药物与磷脂的质量比(P<0.000 1)和磷脂与胆固醇的质量比(P<0.000 1),载药量随着药物与磷脂质量比的增大而先增大后减小,分析是由于当药物与磷脂质量比值较小(药物相对含量低)时,磷脂可以全部将药物包裹于内水相,载药量随着药物量的增加而增大,但当药物与磷脂质量比值较大(磷脂相对含量低)时,则无法将全部药物包裹于脂膜中,导致载药量下降。

本实验采用逆向蒸发法制备ZOL-LIPs,通过Box-Behnken响应面法优化得到ZOL-LIPs的最优处方:药物与磷脂的质量比为0.067,磷脂与胆固醇的质量比为5.503,乙醚与PBS的体积比为1.941。制得的ZOL-LIPs包封率和载药量分别为43.152%和2.257%,与预测值偏差较小,表明Box-Behnken响应面法实验设计科学、合理。

制得的ZOL-LIPs粒径为(197.3±1.7) nm,分布均匀,可减少唑来膦酸在骨骼中的蓄积,使其靶向至肿瘤部位。此外,唑来膦酸包封率和载药量的提高不但可以降低治疗时的给药剂量,而且其在体液pH条件下泄露量少、稳定性好,能有效降低肾毒性。ZOL-LIPs对乳腺癌细胞的抑制作用明显优于ZOL水溶液和空白脂质体。因此,包封率高、粒径小的ZOL-LIPs可为乳腺癌及晚期乳腺癌骨转移的治疗提供新的方法。