氟吡菌酰胺与百菌清混配对灰葡萄孢菌的联合毒力及田间药效

张扬　周飞　郑斐　贾云鹤　李宏伟

摘要［目的］筛选出氟吡菌酰胺与百菌清混配对灰葡萄孢菌的增效组合。［方法］采用菌丝生长速率法测定氟吡菌酰胺与百菌清混配对灰葡萄孢菌菌丝生长的联合毒力，并采用孢子萌发法和田间药效试验对优选出的配比进行验证。 ［结果］氟吡菌酰胺与百菌清以有效成分质量比10∶40、8∶42、6∶44、5.5∶44.5、5∶45、4∶46和3∶47混配抑菌菌丝生长的共毒系数（CTC）均大于120，表现增效作用。混配药剂对孢子萌发的抑制效果随百菌清含量增加而增强。41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂与720 g/L百菌清悬浮剂按照有效成分质量比8∶42桶混在900～1 500 mg/L剂量下对番茄灰霉病的防治效果与对照药剂41.7%氟吡菌酰胺SC（400 mg/L）相当，略优于43%氟菌·肟菌酯SC（400 mg/L），显著优于720 g/L百菌清SC（1 260 mg/L）和50%异菌脲WP（1 000 mg/L）。［结论］氟吡菌酰胺与百菌清按有效成分质量比8∶42混配可以有效防控番茄灰霉病，推荐剂量为900～1 500 mg/L。

关键词氟吡菌酰胺；百菌清；灰葡萄孢菌；联合毒力；田间药效

中图分类号S482.2文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）08-0156-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.036开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Joint Toxicity of Mixing Fluopyram with Chlorothalonil against Botrytis cinerea and Their Field Efficacy against Tomato Grey Mold

ZHANG Yang， ZHOU Fei， ZHENG Fei et al （Shanghai GreenTech Laboratory Co.，Ltd.， Shanghai 201612）

Abstract［Objective］ To screen out the synergistic combination of fluopyram and chlorothalonil against B.cinerea. ［Method］ The joint toxicity of mixing fluopyram with chlorothalonil against B.cinerea was determined by measuring mycelial growth rate test. The conidial germination test and the field efficacy test in controlling tomato gray mould were also carried out to verify the effect of the optimized ratio. ［Result］ The results showed that synergia effect against B. cinerea of mixing fluopyram with chlorothalonil were found at the ratios of 10∶40， 8∶42， 6∶44，5.5∶44.5， 5∶45， 4∶46 and 3∶47， all co-toxicity coefficient （CTC） was greater than 120.The inhibitory effect of the mixture on spore germination increased with the increase of chlorothalonil content. The control effect of fluopyram 41.7% SC and chlorothalonil 720 g/L SC in the dosage of 900-1 500 mg/L according to the mass ratio of 8∶42 was comparable to fluopyram 41.7% SC at the dosage of 400 mg/L， which was better than that of fluopyram and trifloxystrobin 43% SC at the dosage of 400 mg/L and significantly better than chlorothalonil 720 g/L SC and iprodione 50% WP when the treatment dose were 1 260， 1 000 mg/L. ［Conclusion］ The mixture of fluopyram and chlorothalonil at the ratio of 8∶42 could effectively control tomato gray mold， and the recommended dose is 900-1 500 mg/L.

Key wordsFlupiramide;Chlorothalonil;Botrytis cinerea;Joint toxicity;Field efficacy

由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是一種世界性的重要病害，主要危害番茄的茎、叶片、花和果实［1］。灰葡萄孢具有产孢量大、遗传变异快、生命周期短、传播能力强等特点，极易产生抗药性，甚至多重抗药性［2］。国内大量报道田间检测到对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、苯胺基嘧啶类及琥珀酸脱氢酶抑制剂杀菌剂产生抗性的灰葡萄孢菌株［3-7］。

氟吡菌酰胺是由德国拜耳公司研发的一种苯甲酰胺类杀菌剂，其通过抑制呼吸链中琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）的电子转移，阻碍线粒体呼吸，从而抑制病原菌的生长，进而达到控制病害的目的。氟吡菌酰胺对灰葡萄孢菌、白粉病菌和核盘菌等引起的病害效果突出［8］，用于防治灰霉病时，与咯菌腈、啶酰菌胺、嘧霉胺、腐霉利、异菌脲之间均不存在交互抗性［9］。

百菌清是一种广谱高效保护性杀菌剂，广泛应用于蔬菜、果树、大田作物、烟草、草坪等，其与真菌细胞中的三磷酸甘油醛脱氢酶发生作用，与该酶中含有半胱氨酸的蛋白质相结合，从而破坏该酶活性，使真菌细胞的新陈代谢受破坏而失去生命力［10］。近年来，随着杀菌剂抗性管理的需要，百菌清作为传统保护性杀菌剂受到更多关注。百菌清对灰葡萄孢的敏感性较高，与其他灰霉病常规防治药剂相比，对病原菌的抗性水平较低［11］。

目前，化学防治仍是防治番茄灰霉病的主要手段。将作用机制不同的杀菌剂进行合理混配对灰葡萄孢的抗药性治理及延缓抗药性的产生具有重要意义。笔者测定氟吡菌酰胺与百菌清不同配比对灰葡萄孢的联合毒力，旨在筛选出2种药剂的最佳增效配比，为灰霉病的防治及抗性治理提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株。灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），菌株编号2019TF004，由上海晓明检测技术服务有限公司生测实验室长期保存。

1.1.2供试药剂。95%氟吡菌酰胺原药（TC），上海泰禾国际贸易有限公司提供；98%百菌清原药（TC）和720 g/L百菌清悬浮剂（SC），江苏新河农用化工有限公司生产；41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂（SC）和43%氟菌·肟菌酯悬浮剂（SC），拜耳作物科学有限公司生产；50%异菌脲可湿性粉剂（WP），富美实植物保护剂有限公司生产。

1.2方法

1.2.1氟吡菌酰胺与百菌清混配对灰葡萄孢菌的联合毒力测定。抑制菌丝生长：参照行标NY/T 1156.2—2006［12］，采用菌絲生长速率法，分别将适量的氟吡菌酰胺和百菌清原药溶于DMF，然后按照10∶40、8∶42、6∶44、5.5∶44.5、5∶45、4∶46和3∶47的质量比混合，得到不同配比的混合母液。用灭菌的0.1%吐温-80水将混合母液进行系列稀释，与PDA培养基按体积比1∶49的比例混合后制成含药平板，氟吡菌酰胺、百菌清单剂及其混剂的含药平板最终浓度分别为40、16、6.4、2.56、1.02、0.41和0.163 mg/L。将直径5 mm的灰葡萄孢菌菌饼，菌丝面朝下，转接到各含药平板中央，每皿1个菌饼，每处理3次重复，设空白对照，于20 ℃黑暗条件下培养3 d，用十字交叉法测量菌落直径，利用DPS统计分析软件，计算氟吡菌酰胺、百菌清及其混剂的有效抑制中浓度（EC）及相关系数，采用Sun-Johnson（1960）的共毒系数法（CTC）来评价药剂混用的增效作用。根据下列公式计算菌丝生长抑制率：

菌落生长直径=菌落直径平均值-0.5 cm

菌丝生长抑制率=（空白对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/空白对照菌落生长直径×100%

抑制孢子萌发：采用96孔板法［13］，按照上述方法配制氟吡菌酰胺和百菌清单剂及其混剂母液。用灭菌的0.1%吐温-80水将各原药及混合母液进行系列稀释，配制成100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0.195 mg/L的药液。取在PSA培养基上已大量产孢的灰葡萄孢菌平板，用含有0.1%吐温-80、2%葡萄糖和1%酵母膏的洗脱液冲洗下孢子，4层无菌纱布过滤，滤液离心（5 000 r/min，10 min）去除上清液。将孢子重新悬浮于上述洗脱液中，调节孢子浓度至1×105个/mL，制备成孢子悬浮液。每处理取0.5 mL药液和0.5 mL孢子液加入2 mL离心管中充分混匀备用。取孢子液和药液混合液100 μL加入96孔板中，每个处理3个孔，设只含孢子悬浮液的处理为空白对照。96孔板的外围用封口膜封住以减少水分蒸发，然后将其置于20 ℃培养箱中黑暗培养。接种24 h后调查，分别记录孢子萌发数和孢子总数。根据下列公式计算孢子萌发抑制率：

孢子萌发率=孢子萌发数/调查孢子总数×100%

孢子萌发抑制率=（空白对照萌发率-药剂处理萌发率）/空白对照萌发率×100%

1.2.2田间药效试验。田间药效试验于2020和2021年分别在浙江省绍兴市东浦镇行宫山村和上海市奉贤区叶庄公路888号进行，试验地常年种植番茄，灰霉病较易发生。

2020年试验：番茄，品种为合作903，日光大棚内栽培，于2020年9月15日移栽，株行距40 cm×40 cm。试验设9个处理，分别为41.7%氟吡菌酰胺SC与720 g/L百菌清SC混合物（质量比1∶5.25）900、1 200、1 500 mg/L（均为有效剂量，下同），41.7%氟吡菌酰胺SC 240 mg/L，720 g/L百菌清SC 1 260 mg/L，43%氟菌·肟菌酯SC 400 mg/L，50%异菌脲WP 1 000 mg/L和清水对照。各小区随机排列，每处理3次重复，小区面积10 m。2020年11月25日（番茄始花期，灰霉病零星发生）和12月4日分别进行第一次和第二次施药，共用药2次。

2021年试验：番茄，品种为粉太郎，于2020年12月14日移栽，试验处理及种植模式与2020年相同。2次施药时间分别是3月2日（始花期）和3月13日。

2次试验使用中保绿农背负式电动喷雾器对番茄进行均匀喷雾，喷施药液时以叶面湿润而不滴水为宜，如实记录喷液量。病情调查参考农药田间药效试验准则（GB/T 17980.28—2000）。施药前，番茄叶片上灰霉病零星发生，病情基数视为0。末次用药后10 d调查发病情况，调查每小区全部果实。计算病情指数及防效。

病情指数=∑（各级病果数×相对级数值）/（调查总果数×9）×100

防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%

1.3数据统计与分析采用DPS v16.05数据处理软件进行分析，采用邓肯氏新复极差法（DMRT）进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1氟吡菌酰胺与百菌清混配对灰葡萄孢的联合毒力氟吡菌酰胺、氟吡菌酰胺与百菌清不同配比对灰葡萄孢菌表现出较高的毒力。氟吡菌酰胺与百菌清在不同质量比下对灰葡萄孢菌均表现增效作用，在质量比为10∶40和8∶42时，共毒系数分别为223和215，对灰葡萄孢的毒力最强（表1）。百菌清对灰葡萄孢菌的菌丝抑制作用较弱。

氟吡菌酰胺和百菌清对灰葡萄孢菌的孢子萌发均表现出一定抑制作用，24 h显微镜下调查孢子萌发情况，百菌清在1.56 mg/L剂量下可完全抑制灰葡萄孢菌的孢子萌发，该剂量下，氟吡菌酰胺孢子萌发抑制率仅为2%。氟吡菌酰胺在100 mg/L剂量下对灰葡萄孢菌的孢子萌发抑制率接近100%。混配药剂中，百菌清的含量越高，药剂对孢子的抑制作用越强（图1）。

2.2田间药效试验2020年的田间试验结果表明（表2），41.7%氟吡菌酰胺 SC与720 g/L百菌清SC按有效成分质量比8∶42混配对番茄灰霉病表现出良好的防治效果，且对作物安全。在混配有效用量为900、1 200、1 500 mg/L时，对番茄灰霉病的防效分别为80.01%、81.67%和89.33%，混配药剂的防效呈现一定剂量反应。3个混配处理对番茄灰霉病的防效与单独施用41.7%氟吡菌酰胺SC（240 mg/L）无显著差异，略优于43%氟菌·肟菌酯SC（400 mg/L），显著优于720 g/L百菌清SC（1 260 mg/L）和50%异菌脲WP（1 000 mg/L）的防效。2021年的田试结果与2020年基本一致。

3结论与讨论

杀菌剂的联合作用与选择的靶标、菌种本身特性、单剂表现、组合比例、菌体生活阶段、试验方法等多种因素有关［14］。Sun-Johnson方法是评价杀菌剂联合作用的主要方法之一，因此该研究在采用菌丝生长速率法进行联合毒力测定的基础上，同时采用孢子萌发法对混配药剂的孢子萌发抑制效果进行了验证，并进行田间桶混试验，对室内筛选出的增效组合进行药效评价。结果表明，采用Sun-Johnson法分析发现氟吡菌酰胺和百菌清按有效成分质量比10∶40、8∶42、6∶44、5.5∶44.5、5∶45、4∶46和3∶47混配的共毒系数（CTC）均大于120，表现增效作用。此外，在田间试验中，41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂与720 g/L百菌清悬浮剂按照有效成分质量比8∶42桶混，在900、1 200、1 500 mg/L剂量下对番茄灰霉病的防效与单独施用41.7%氟吡菌酰胺SC（240 mg/L）无显著差异，显著优于720 g/L百菌清SC（1 260 mg/L）单剂的防效，表明2种药剂混合使用后降低单剂用量仍可以达到较优的防治效果。

该研究结果发现，氟吡菌酰胺和百菌清对灰葡萄孢菌表现出不同作用特性。2种药剂对灰葡萄孢菌的菌丝生长和孢子萌发均有一定抑制作用［15-16］。氟吡菌酰胺对灰葡萄孢菌菌丝生长的抑制作用显著优于百菌清，以EC50值进行评价，氟吡菌酰胺的活性是百菌清的4～9倍。采用96孔板法测定氟吡菌酰胺和百菌清对灰葡萄孢菌孢子萌发的抑制作用，百菌清对灰霉病菌孢子萌发的抑制作用显著优于氟吡菌酰胺，以完全抑制孢子萌发的药剂浓度进行评价，百菌清的活性约是氟吡菌酰胺的64倍。在番茄灰霉病田间试验中，因2年试验均于番茄灰霉病始发期施药，试验中百菌清单剂对番茄灰霉病的防效较常规防治效果差，但当百菌清与氟吡菌酰胺桶混使用时，两者表现相加作用，对番茄灰霉病的防效优于相同剂量下单剂的防效。上述研究结果进一步表明，氟吡菌酰胺和百菌清分別作用于灰葡萄孢菌的不同发育阶段，将这2种作用机制不同的杀菌剂进行合理混配对灰葡萄孢菌的抗药性治理、延缓抗药性的产生及弥补单一药剂自身缺陷具有重要意义。

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