骨质疏松症动物模型造模方法的研究进展

赵建栋 郭成龙 柴威涛 任行全 毕煦昆 张效收 刘贝

【摘 要】 骨质疏松症是一种全球性疾病。动物模型的研究应用为人们研究疾病提供了一种切实有效的方法，病证结合骨质疏松症动物模型则可以为中医药防治骨质疏松症提供一个可行有效且便捷的机体，避免直接在人体进行实验而产生如伦理学等一系列问题。收集总结迄今为止有关骨质疏松症动物模型及病证结合骨质疏松症动物模型的研究现状，为研究工作者提供思路。

【关键词】 骨质疏松症；动物模型；造模；病证结合；证型造模；研究进展；综述

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是指单位体积正常矿化骨的骨量减少，骨基质及矿盐平行减少，骨脆性增加，从而易发生骨折的一种疾病，主要病因有内分泌因素、营养因素、药物因素等。OP患者既有骨质疏松表现又伴随腰背疼痛、骨折、驼背、功能障碍。OP可分为原发性和继发性两种，原发性OP主要是指退行性骨质疏松，可分为Ⅰ型（绝经后骨质疏松）和Ⅱ型（老年骨质疏松），继发性OP主要包括疾病、药物或其他原因导致的骨质疏松［1］。运用导致OP的病因可以指导科研工作者进行OP动物造模，比如切除小鼠双侧卵巢可复制绝经后OP，小鼠腹腔注射D-半乳糖可以复制衰老导致的老年性OP，长期使用大剂量糖皮质激素、腿尾固定、链脲佐菌素诱导的1型糖尿病大鼠的糖尿病骨质流失等可复制继发性OP。

1 OP的概况

1.1 中医学对OP的认识 中医学将OP归属于“骨痿”“骨痹”范畴［2］，认为肾虚是根本，脾虚是主要病机，血瘀是病理产物。按照2020《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识》［3］将OP分为阳虚证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证、肾虚血瘀证、脾胃虚弱证和气滞血瘀证6个证型。

1.2 病证结合动物模型常用观察指标 OP造模的观察指标有甲状旁腺激素（PTH）、活性维生素D、降钙素、骨性碱性磷酸酶（BALP）、Ⅰ型胶原N端前肽（PINP）、骨钙素（BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP 5b）等［1］。OP新型炎症指标：中性粒细胞/淋巴细胞比率（NLR）、全身免疫炎症指数（SII）与OP、单核细胞/淋巴细胞比率（MLR）、血小板/淋巴细胞比率（PLR）［4］。动物OP在骨微结构改变的基础上肾阴虚表现为形体消瘦，大便干结，小便赤黄，自主活动增加等；肾阳虚表现为拱背蜷曲，畏寒喜暖，肛温降低，反应迟钝，呼吸深迟，毛发干枯，消瘦，尿液清长等；脾肾阳虚表现为毛发无光泽，掉毛现象，爪甲颜色变浅，大便较稀软，甚者如水状等。

2 常规OP动物造模方法

2.1 手术方法

2.1.1 手术去势法 女性因卵巢功能减退致体内雌激素水平降低，导致一系列细胞因子分泌失调，使得成骨与破骨平衡打破，最终诱发绝经后骨质疏松（PMOP）［5］，用手术方法摘除实验动物单侧或双侧卵巢，可以模拟绝经后OP动物模型［6］。此法为最常用的PMOP造模方法，可以很好地模拟OP，缺点是直接切除双侧卵巢导致实验动物雌激素骤降，与实际PMOP不符。为了避免出现这种现象，切除单侧卵巢不失为一种改良方法，这种改良也存在实验动物体内雌激素骤降的问题，但相对于切除双侧稍有缓和。手术去势法会对实验动物造成创伤，比如感染，影响实验结果，此时可考虑使用抗生素，但会导致肠道菌群紊乱。有人研究肠道菌群与OP相关［7］，使用抗生素亦可影响实验结果。手术后实验动物可能因疼痛导致废用，使用镇痛药物亦或对实验产生影响。手术去势法虽是目前PMOP常用造模方法，但其缺点也较为显著。人类罹患疾病是长期而复杂的过程，想得到相对完美的模型将需要长期的探索过程。

2.1.2 坐骨神经切断法 通过手术方法切断模型动物的单侧或双侧坐骨神经可有效建立废用性骨质疏松症（DOP）［8］。

2.1.3 脊髓切断法 脊髓损伤（SCI）常伴有骨盆和下肢病变区域的OP，增加骨折的风险，通过手术行椎板切除术，将脊髓完全横切可复制DOP［9］。

2.1.4 臂丛神经切除法 黄昌钊等［10］将兔一侧全臂丛神经于锁骨下镜下分离至神经根孔处切断，造模后发现肱骨骨密度、干重明显降低，骨的力学强度指标较对照侧明显减弱，表明切除臂丛神经可以模拟DOP。

坐骨神經切断、脊髓切断、臂丛神经切除均可模拟DOP，DOP是因为骨骼机械负荷力的减少而引起局部或全身骨量丢失［11］，为OP病因之一。通过手术方法使得模型动物骨骼机械负荷力减少从而模拟DOP，但是这3种方法也都使用手术，上述手术对OP的影响均有可能发生。

2.1.5 甲状旁腺切除法 甲状旁腺主要功能是分泌PTH，PTH可增强肾小管和肠道对体内钙的重吸收能力，体内钙和磷的代谢平衡被破坏，导致骨质溶解［12］。洪志勇等［13］实验证明，切除双侧甲状旁腺可致大鼠OP。这种手术难度高，不确定性因素多，相关报道较少，能参考的文献也较陈旧。

2.2 药物方法

2.2.1 非手术去势法 此方法与手术去势法都使得机体雌激素下降，导致PMOP，可以很好地模拟绝经后OP动物模型［14］。此种方法虽然消除手术因素构建PMOP，但药物的使用也会对实验结果产生影响。

2.2.2 糖皮质激素法 糖皮质激素是导致OP的重要原因之一，长期大量使用糖皮质激素可导致成骨细胞的破坏、破骨细胞被活化及减少肠道对钙磷的吸收［15］。采用灌胃、注射糖皮质激素或皮下植入缓释糖皮质激素药物，通过给予影响动物内分泌功能的药物抑制生理状态下的雌激素分泌，建立OP模型［16］。袁雪梅等［17］给予雄性Wistar大鼠肌内注射泼尼松龙，祝佳音等［18］给予小鼠臀部肌内注射地塞米松，通过注射糖皮质激素均使得实验动物发生OP。运用糖皮质激素可以很好地模拟药物源性OP，使用这种方法的人数较多，相关文献比较齐全，此种方法已相对成熟，可以合理使用。

2.2.3 D-半乳糖模型 D-半乳糖可以导致机体衰老，腹腔注射D-半乳糖，可以复制衰老导致的OP［19］。模拟老年性OP的想法较少，这是相对常用的一种，研究老年性OP药物的科研工作者可以选择此种方法。

2.2.4 维甲酸模型 维甲酸灌胃造模［20］，维甲酸可降低正常人成骨细胞活性，抑制成骨细胞的增殖［21］，刺激破骨细胞使其活性增强［22］。

2.2.5 谷氨酸单钠法 谷氨酸单钠能够选择性损害动物下丘脑弓状核神经元，导致神经内分泌调节功能紊乱，诱发骨小梁厚度及数量减少，进而导致骨量减少、骨结构显著破坏等OP表现，这类OP在学术上被称作脑源性OP［23］。

2.2.6 乙醇法 乙醇会导致间充质干细胞过早衰老，长期大量使用乙醇也可以构建OP模型［24］。

2.3 物理方法

2.3.1 X射线 X射线照射则导致细胞有丝分裂的不同阶段均有损伤［25］。

2.3.2 γ射线 电离辐射会导致卵母细胞丢失和卵巢萎缩，使卵巢功能丧失，可模拟围绝经期OP［26］。

采用X、γ射线辐射方法，破坏卵巢功能，使动物模型处于围绝经期，消除了手术、药物等因素的影响而成功模拟PMOP。

2.3.3 外固定法 有学者采用喇叭型套筒套入左、右后肢根部，观察到大鼠股骨的骨小梁体积变小，骨矿物质含量等指标显著下降，成功建立OP模型［27］。

2.3.4 悬吊法 又名腿尾固定，后腿抬高头朝下倾斜30°，人为造成动物失重或者模拟失重状态，使骨质水平降低，钙磷代谢处于负平衡，最终导致骨质丢失［27］。

外固定法和悬吊法单纯使用物理方法模拟DOP，消除了手术、药物等因素的影响。

2.4 其他方法

2.4.1 吸烟 有研究显示，戒烟可降低骨量的减少［28］，机体过度吸入烟草会对骨代谢产生有害影响，易患OP。FRANCO等［29］研究发现，将Wistar大鼠在吸烟箱中被动吸烟可致大鼠OP。

2.4.2 基因 超过100种目的基因参与OP发生、发展过程，采用基因敲除法可构建OP动物模型［30］。

2.4.3 铁超载法 有研究通过注射枸橼酸铁铵，将机体暴露于高铁环境下可诱导成骨缺陷，培养出快速、稳定的斑马幼鱼和成鱼的OP模型，可广泛用于未来的OP药物筛选［31］。

2.4.4 链脲佐菌素法 链脲佐菌素可以诱导1型糖尿病大鼠的糖尿病骨质流失，可在镜下观察到大鼠骨小梁密度降低［32］。

2.4.5 冬眠熊 有学者研究DOP时对冬眠熊进行相关研究，提出冬眠熊在冬眠期间为何不发生OP的疑问。DONAHUE等［33］研究发现，冬眠熊在冬眠期间每天会发生身体颤动4～5次，这种轻微的机械运动可防止OP的发生，破坏这种机械运动可致冬眠熊患OP。

3 病证结合OP动物模型方法

病证结合动物模型是指将实验动物通过一定的实验方法构造出既符合西医学疾病的常规特点，同时又符合中医学证候特点的特殊造模方法［34］。具体方法是用常规的OP动物造模方法构造出大家所公认的西医学OP，再通过中医证型造模方法构造出OP中医证型。目前常规的OP动物造模方法甚多，病证结合OP动物模型较少，仅有肾阴虚、肾阳虚、脾肾阳虚3种。肾阴虚表现为形体消瘦、大便干结、小便赤黄、自主活动增加等，有研究者给小鼠灌服甲状腺片混悬液，注射地塞米松后小鼠会出现形体消瘦、大便干结等症状［35］，表明小鼠肾阴虚模型已经建立。小鼠注射氢化可的松可表现为拱背蜷曲、畏寒喜暖、肛温降低等肾阳虚症状［36］，大黄泻下法可致小鼠毛发无光泽、掉毛现象、爪甲颜色变浅、大便较稀软，甚者如水状等脾肾阳虚症状［37］。利用OP常规造模加中医证型造模方法可建立病证结合OP动物模型。

3.1 肾阴虚 夏炳江等［38］采用手术去势法切除昆明小鼠双侧卵巢，再给小鼠每天灌服甲状腺片混悬液，之后成功复制OP肾阴虚病证结合模型。夏炳江等［39］用地塞米松单一因素构建OP肾阴虚小鼠模型，该实验模型组注射地塞米松后注射生理盐水，药物反证组注射地塞米松后以六味地黄丸混悬液灌胃，模型组小鼠出现了典型OP病理学表现。模型组出现烦躁不安，活动频繁，毛发枯槁、无光泽、易脱落，饮水增多，小便赤黄等类似阴虚的表现，而药物反证组小鼠则表现良好，从而反证出地塞米松可致小鼠肾阴虚，用地塞米松这一单一因素既致小鼠OP又致小鼠肾阴虚。

3.2 肾阳虚 陈剑磨等［40］用手术去势法切除昆明小鼠双侧卵巢后间隔7周，按25 mg·kg-1皮下注射氢化可的松1周，8周时OP模型和肾阳虚造模同时结束。观察到昆明小鼠出现骨小梁排列稀疏、变细、微骨折等OP临床表现，同时出现了畏寒倦卧、精神萎靡、反应迟钝、体质量下降等肾阳虚证候，证明成功建立了OP肾阳虚模型。曹端广等［41］用维甲酸灌胃、氢化可的松臀部肌内注射的方法构建肾阳虚OP病证结合动物模型，选取SD大鼠，将维甲酸和质量分数为1%的羧甲基纤维素钠混合，持续2周按每日80 mg·kg-1灌胃，并同时每日按2 mg·kg-1臀部肌内注射氢化可的松，模型复制成功后观察到模型组大鼠有神疲、发力、静卧、小便多等肾阳虚表现，且与空白对照组大鼠比较，模型组大鼠骨密度显著降低，证明成功建立了OP肾阳虚模型。

3.3 脾肾两虚 郑洪新等［42］证实切除卵巢可造成肾虚型OP动物模型。李燕舞等［43］证实大黄泻下法可致大鼠脾虚。刘梅洁等［44］则在前者基础上先切除大鼠卵巢，在用质量分数为200%的大黄浓煎液灌胃，同时得到脾肾两虚OP动物模型。邓强等［45］先用手术去势法切除大鼠卵巢，再注射氢化可的松加番泻叶灌胃加饮食失节加劳倦过度的方法复制脾肾阳虚OP模型。造模5周后大鼠出现大便清稀如水状、爪甲颜色變淡、毛发枯槁无华、尾巴发凉、弓背蜷卧、喜好抱团扎堆等脾肾阳虚症状，且模型组大鼠血清骨碱性磷酸酶含量低于正常组和假手术组，提示模型组大鼠患OP，说明用此法也可成功构建脾肾阳虚OP动物模型。

4 小结和展望

OP动物模型的建立为探究发病机制、病理研究、临床药物的开发应用提供了很好的机体，使对OP的认识更加清晰。虽然OP造模方法众多，但是又各有弊端，不能完全模拟人体各种OP，所以科研工作者们应当集思广益，继续发掘OP造模方法。中医药虽然对OP有独特的优势，但是在当代大环境下，优势没有完全展现出来，就如上述OP有多个中医证型，但病证结合动物模型只有肾阴虚、肾阳虚和脾肾阳虚3个模型。目前，中医证型造模方法较多，是否可以按上述病证结合的原理，尽可能多进行一些造模实验，进一步挖掘中医药的优势。我们当实事求是对一些有瑕疵的方法进行改进，并继续创新方法，以求最理想的动物模型。

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收稿日期：2022-12-10；修回日期：2023-01-08

基金项目：甘肃省自然科学基金项目（18JR3RA074）

作者单位：1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000

通信作者：郭成龙