福建省稻瘟病菌田间种群无毒基因的变异检测

项旭跃　曹雪琦　魏立婧　郑华坤　鲁国东

关键词：水稻；稻瘟病菌；致病性；无毒基因

中图分类号：S435.111.41 文献标识码：A

稻瘟病是由丝状子囊真菌稻瘟病菌（Pyricularia oryzae; syn. Magnaporthe oryzae）引起的病害，严重威胁水稻生产[1]。水稻是福建省最主要的粮食作物。但是，丘陵地带形成的高温高湿的地理环境导致稻瘟病常年流行，严重威胁福建省水稻产量和质量[2]。当前稻瘟病最主要的防控策略是培育和种植抗病水稻品种，并适时施用化学农药。但是，化学农药的使用会造成环境污染，并且需在发病早期施用才有效果，例如三环唑可抑制黑色素形成、只在附着胞发育过程中发挥作用[3]。目前福建省的水稻主栽品种携带一些主效抗病基因[4]。这些品种通常会因为稻瘟病菌田间群体无毒基因的快速变异而丧失抗性[5-9]。因此，加强对福建省田间稻瘟病菌群体无毒基因分布及其变异特征的检测，可有效指导福建省抗病水稻品种的布局和轮换，对于实现稻瘟病的绿色生态防控具有重要意义。

目前稻瘟病菌群体无毒基因鉴定主要有2 种方式：一是利用携带不同抗病基因的单基因系进行致病性分析；二是通过扩增和检测已克隆无毒基因的序列。自1967 年ALKINS 等[10]建立第一套稻瘟病菌鉴别品种以来，包括我国在内的很多国家均建立了稻瘟病菌鉴别体系[11]。目前，比较常用的单基因鉴别品种有国际水稻研究所以‘丽江新团黑谷为背景育成的24 个单基因系品种和以‘Co39为背景育成的5 个单基因系品种。这些鉴定品系已在云南[12]、福建[13]、海南[14]和黑龙江[15-17]等地稻瘟病菌田间菌株毒性鉴定方面得到广泛应用。但该方法费时费力、受环境影响较大，且无法及时反馈给稻瘟病田间防控提供参考。随着分子生物学技术的发展，尤其是稻瘟病菌无毒基因的克隆，使稻瘟病菌谱系与无毒基因之间的关系基本实现一一对应，同时也方便了田间稻瘟病菌毒性变异的实时监测。

为了检测无毒基因在福建省稻瘟病菌田间群体的分布情况，本研究利用抗瘟单基因系对从福建省3 个水稻主产区分离的113 个单孢菌株进行致病力分析，并对8 个无毒基因（Avr-Pita、Avr-Pib、Avr-Pik、Avr-Piz-t、Avr-Pii、Avr-Pi9、Avr-Pi54 和Avr1-Co39）的基因型进行检测。研究结果可为福建省水稻品种的合理布局提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病样采集、单孢分离及保存 2018—2019年从福建省3 个水稻主要栽培地区的水稻品种上采集并分离得到稻瘟菌单孢株113 株，其中建阳23 株，宁化68 株，上杭22 株（表1）。稻瘟病菌单孢分离采用保湿培养法[18]，将发病的水稻穗颈剪下，于75%酒精消毒后，用无菌蒸馏水冲洗3次，置于培养箱中光照诱导产孢。1～2 d 后，在显微镜下用针挑转移法[19]分离单孢至贴有滤纸片的米糠培养基上（40 g/L 米糠、18 g/L 琼脂粉），置于28℃培养箱中光照培养7 d 后，收集滤纸片低温干燥保存。

1.1.2 供试水稻品种 供试水稻为国际水稻研究所以‘丽江新团黑谷（LTH）为背景育成的24个单基因系水稻品种[20]。

1.2 方法

1.2.1 致病性检测 水稻栽培：将24 个单基因系水稻品种种子先进行催芽处理，然后将发芽的种子播种于塑料育苗盘中，每行播种4 个品种，共6 行，每穴15～20 粒种子。每天浇水，隔天浇营养液，待水稻长至三叶一心时进行喷雾接种。

孢子悬浮液的制备及接种：先将保存在滤纸片的菌株在CM 培养基上活化培养，生长3～5 d后转移至米糠培养基上产孢培养。待米糠培养基长满菌丝后，用灭菌盖玻片刮掉菌丝，置于光照培养箱中光照培养2～3 d。至培养基上布满灰色霉层时，用含有0.02%吐温的双蒸水将孢子洗脱下来，制备孢子悬浮液（5×104～10×104 个/mL）。然后将孢子悬浮液均匀地喷洒到水稻叶片表面。接种完成后置于接种室黑暗处理24 h，然后在自然光照下放置5～7 d，保持适宜的温度湿度有利于发病[21]。

1.2.2 分级标准及病情调查 接种5～7 d 后，参照IRRI 的调查标准对水稻叶片上的病斑进行调查[22]，如果同一株水稻叶片上的病斑类型不一致，则以病斑最为严重的类型为准。病斑反应型的记载标准参照VALENT 等[23]的方法。

统计供试菌株对各水稻品种的毒力频率（VF）和致病频率（PF），毒力频率不仅可以表示病原物种内一系列菌株对一个寄主品种的毒力，还可以用来衡量一个品种对病原物群体的抗性[24-25]。计算公式：VF=（有毒菌株数量/菌株总数量）×100%；PF=（ 感病水稻品种数/ 供试水稻品种总数）×100%。其中，PF≥70%，为强致病力菌株；50%≤PF<70%，为较强致病力菌株；20%≤PF<50%，为中等致病力菌株；PF<20%，为弱致病力菌株[13， 26]。毒力频率的强弱分级标准与致病频率相似。

1.2.3 无毒基因体外扩增与测序分析 稻瘟菌基因组DNA 提取：在2 mL 的离心管中加入200 mL石英砂和400 mL DNA 1 mol/L KCl 溶液；取一小块含有菌丝的培养基加入2 mL 离心管，65 Hz，120 s振荡破碎；12 000 r/min 离心10 min；吸取200 mL上清至新的1.5 mL 无菌的离心管，加入500 mL預冷的无水乙醇，–20℃放置1 h；12 000 r/min 离心10 min；加入1 mL 70%乙醇；7500 r/min 离心5 min 后，弃上清；用枪头将残余溶液吸干，放置5 min，加入100 mL ddH2O，于–20℃保存备用。

PCR 扩增体系（18 μL）：16 μL 1.1×T3 SuperPCR Mix（擎科公司），0.5 μL Primer F，0.5 μL PrimerR，1 μL 模板DNA。扩增8 个无毒基因所用引物如表2 所示，其中扩增Avr-Pita、Avr-Pii、Avr-Pi9、Avr-Co39 的引物参照SELISANA 等[ 2 7 ]，其余无毒基因的引物为本研究根据NCBI 所载基因序列自行设计。扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果通过NCBI（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 福建稻瘟病菌对单基因系水稻品种的致病性分析

为了研究福建省稻瘟病菌群体无毒基因的分布情况，首先利用24 个单基因系水稻品种对从建阳、宁化和上杭分离的113 个单孢菌株进行致病力和毒力频率分析。

2.1.1 稻瘟病菌致病力分析 对24 个单基因系水稻的接种结果显示，建阳23 个稻瘟病菌株的致病频率介于12.50%～95.83%之间。其中强致病力菌株、较强致病力菌株、中等致病力和弱致病力菌株数分别为14、7、1、1 个（表3），占检测菌株总数的60.87%、30.43%、4.35%、4.35%。表明强致病力的菌株在该区域占优势，即建阳地区多数菌株对这些已知抗性的水稻品种具有强致病力。对宁化地区采集的68 个稻瘟菌株的致病性检测结果显示，这68 株稻瘟病菌对24 个单基因系水稻的致病频率介于29.17%～100%之间。其中强致病力菌株、较强致病力菌株、中等致病力和弱致病力菌株数分别为37、21、10、0 个，占检测菌株总数的54.41%、30.88%、14.71%、0%。表明强致病力菌株在宁化地区占优势。对上杭地区采集的22 个稻瘟菌株的致病性检测结果显示，这22 株稻瘟病菌对24 个单基因系水稻的致病频率介于4.55%～86.36%之间。其中强致病力菌株、较强致病力菌株、中等致病力和弱致病力菌株数分别为4、6、9、3 个，占检测菌株总数的18.18%、27.27%、40.91%、13.64%。表明中等致病力菌株在上杭地区占优势。

综合分析3个地区稻瘟菌株的致病力情况（表3），发现其中强致病力菌株、较强致病力菌株、中等致病力和弱致病力菌株数分别为55、34、20、4 个，占检测菌株总数的48.67%、30.09%、17.70%、3.54%，说明福建省这3 个地区的稻瘟菌株具有较强的致病力。

2.1.2 福建稻瘟病菌毒力频率分析 通过致病性分析结果显示，建阳、宁化和上杭3 个地区不同稻瘟群体对24 个抗性单基因系水稻呈现出不同的毒力水平（表4）。其中，建阳地区23 株稻瘟病菌对Pit 的毒力频率（VF）最高，达到100%；宁化地区68 株稻瘟病菌对Pib 的毒力频率最高，达到100%；上杭地区22 株稻瘟病菌对Pib、Piks的毒力频率最高，达到86.36%。根据毒力频率进一步将3 个地区稻瘟菌株对不同抗性单基因系水稻的毒力水平划分为强毒力（VF≥70%），中等毒力（20%≤VF<50）和弱毒力（VF<20%）3 个等级。分析发现，建阳和宁化地区菌株对Pia、Pii、Piks、Piz、Pib、Pit、Pis^h、Pi3、Pi5、Pi7、Pi12、Pi19、Pi20、Pita²、Pi11、Piz^t 和Pita 均表现为强毒力，而上杭地區菌株则对Pik^s、Pib、Pi3 和Pi12表现为强毒力，表明携带以上抗性基因的水稻品种不再适宜在相应的地区推广。建阳地区和宁化地区菌株未对任何检测的抗性基因表现出弱毒性，而上杭地区菌株对6 个抗性基因Pik、Pikｐ、Pik^h、Pi1、Pi9 和Pik^m表现为弱毒性。建阳和宁化地区菌株表现为中等毒力的抗性基因与上杭地区菌株表现为弱毒力的抗性基因一致，表明上杭稻瘟菌株的毒力频率相对最低，并且含有Pik、Pik^p、Pik^h、Pi1、Pi9 和Pik^m这6 个抗性基因的水稻品种仍然适合在这3 个地区推广。

综合分析3 个地区稻瘟菌株的毒力频率（表4），发现这113 个稻瘟菌株对Pib 的毒力频率最高，达到95.58%；并对其中9 个抗性基因Pii、Piks、Pib、Pi3、Pi12、Pi19、Pi20、Pita2、Pi11表现出强毒力，表明携带这9 个抗性基因的水稻品种不再适合在福建省推广；此外，所有菌株对7 个抗性基因Pik、Pikp、Pikh、Piz5、Pi1、Pi9 和Pikm 表现出中等毒力，表明携带这7 个抗性基因的水稻目前仍适合在福建省推广。

通过3 个地区稻瘟病菌群体对24 个水稻单基因系品种抗瘟基因的毒力频率来计算无毒基因的存在频率（存在频率=1-毒力频率），发现建阳地区Avr-Pit、Avr-Pi19、Avr-Pi11 的存在频率最低，分别为0%、4.35%、4.35%；宁化地区Avr-Pib、Avr-Pi12、Avr-Pita²的存在频率最低，分别为0%、2.94%、4.41%；上杭地区Avr-Piks、Avr-Pib 的存在频率最低，仅为13.64%。综合分析3 个地区稻瘟菌株的毒力频率（表4），发现这113 个稻瘟菌株中Pib、Pii、Pik^s、Piz、Piz^t、Pita、Pib、Pit、Pi3、Pi7、pi12、Pi19、Pi20、Pita2 和Pi11 这14个Pi 基因对应的无毒基因的存在频率较低，尤其Avr-Pib 的存在频率仅为4.42%。以上结果表明上述14 个抗性基因在相应的地区已无利用价值。

2.2 稻瘟病菌无毒基因检测

为进一步检测福建省3 个不同的水稻种植地区113 个稻瘟菌株中已克隆无毒基因的变异情况，本研究通过PCR 扩增的方法对不同无毒基因的存在/缺失多态性进行分析，并通过测序的方法检测其中一些菌株无毒基因的序列突变。

2.2.1 福建省不同地区无毒基因存在/缺失多态性检测 通过分析8 个无毒基因在福建省3 个水稻种植地区的分布情况，由表5 可知，这几个无毒基因在3 个地区的出现频率具有较大的差异。

Avr-Pik、Avr-Pi54、Avr-Pii 在福建省3 个区域的检出频率均超过90%（表5），说明这3 个基因在这些区域分布广泛。Avr-Pita 在建阳地区未检测到，但在宁化和上杭地区的检出频率较高，均超过60%。Avr-Pib 在这3 个地区的检出频率均较低。Avr-Piz-t 在上杭地区的检出频率较低，仅为9.09%。但是所有菌株中均未检测到Avr-Co39产物条带，表明福建省这3 个地区的稻瘟病菌均未携带这个无毒基因。此外，Avr-Pib 的出现频率也较小，仅为37.17%，但是该数值仍远超致病性鉴定的结果（4.42%），表明检测到的Avr-Pib 中部分是存在突变的。

2.2.2 无毒基因序列分析 除了缺失突变，无毒基因还可能存在不同形式的突变。为此，通过PCR扩增不同菌株无毒基因进行测序分析。

（1）无毒基因Avr-Pib 序列分析。将4 个宁化田间稻瘟菌株PCR 产物测序结果与NCBI 数据库中Avr-Pib 的参考序列进行比对，结果显示，这4 个菌株中Avr-Pib 的ORF 序列均未发生突变，突变主要发生在起始密码子（ATG）前的15～32 bp之间，突变类型包括缺失、插入和替换（图1）。这些突变虽然未改变编码的氨基酸序列，但是可能影响该基因的表达，从而导致无毒基因功能的丧失。

（2）无毒基因Avr-Pik^h序列分析。将宁化稻瘟菌株NH2019056 和NH2019059 的测序结果与NCBI 数据库中Avr-Pik^h的序列进行比对，结果显示（图2），这2 个宁化菌株中Avr-Pik^h的突变均发生在启动子区域，包括-296、-279、-246、-45 bp。此外，NH2019056 在-432 bp 处还有一个额外的点突变。这些位点的差异可能影响Avr-Pikh 正常的时空表达模式，从而使该基因无毒功能的丧失。

（3）无毒基因Avr-Pita 序列分析。将宁化稻瘟菌株NH2019010 和NH2019012 扩增的Avr-Pita产物测序与数据库中Avr-Pita 进行比对，发现NH2019010 和NH2019012 菌株突变类型和所对应的位点一致，并且均为碱基替换（图3），共发生7 处碱基替换，分别是24 bp 处碱基C 变为T，62 bp 处碱基G 变为A，80 bp 处碱基A 变为G，129 bp 处碱基T 变为G，224 bp 处碱基A 变为G，323 bp 处碱基G 变为T，337 bp 处碱基A 变为G。将测序后得到的NH2019010 和NH2019012 菌株CDS 序列翻译成氨基酸序列，并与标准的Avr-Pita氨基酸序列进行比对，在第21 个氨基酸由丝氨酸（Ser）变为天冬酰胺（Asn），27 位由赖氨酸（Lys）变为脯氨酸（Pro），43 位由天冬酰胺（Asn）变为赖氨酸（Lys），在75 位由谷氨酸（Glu）变为甘氨酸（Gly），108 位由甘氨酸（Gly）变为缬氨酸（Val），113 位由异亮氨酸（Ile）变为缬氨酸（Val）。这2 个宁化菌株Avr-Pita 中6 个氨基酸的改变可能改变蛋白质的结构和活性，从而导致Avr-Pita 无毒功能的丧失。

（4）无毒基因Avr-Pi9 序列分析。测序比对结果表明，上杭稻瘟菌株SH2019018 中Avr-Pi9的ORF 333 bp 处插入一个鸟嘌呤（G），导致其最后10 个氨基酸残基的移码突变（图4），并可能因此导致该菌株可以侵染Pi9 水稻株系。

此外，本研究还检测到3 个上杭稻瘟菌株SH2019015、SH2019017 和SH2019019 中Avr-Piz-t均在启动子上游缺失一个腺嘌呤（A）（图5），并可能因此而改变基因的表达。

3 讨论

福建省不同区域稻瘟病菌田间群体致病频率和毒力频率存在较大差异。不同地区稻瘟病菌群体受水稻栽培品种和温度、湿度等气候条件的影响，可能产生较大的差异[28]。本研究对福建省建阳、宁化和上杭的113 个稻瘟单孢菌株进行致病性分析，总体而言，这3 個地区的稻瘟病菌群体对所检测的24 个抗病单基因系具有较强的致病性：强致病力菌株和较强致病力菌株分别占检测总菌株数的48.67%和30.09%。并且建阳和宁化稻瘟病菌群体的致病频率和毒力频率较为相近，而与上杭稻瘟病菌群体差异较大。其中，最明显的是建阳和宁化稻瘟菌株均未对任何检测的抗性基因表现出弱毒性，并对6 个抗性基因Pik、Pik^p、Pik^h、Pi1、Pi9 和Pik^m表现为中等毒性；相比之下，上杭稻瘟菌株对这6 个抗性基因表现为弱毒力。

对8 个无毒基因的检测结果显示，上杭稻瘟群体中Avr-Piz-t 和建阳稻瘟群体Avr-Pita 的检出频率极低，而Avr-Pib 在建阳和上杭稻瘟群体中的检出频率也较低。表明这些基因不再适宜作为抗源在这些地区推广。此外，福建省这3 个地区稻瘟群体中均不存在Avr-Co39，这个结果与前人的研究结果[29]一致，表明侵染水稻的稻瘟群体中很少携带该无毒基因。通过比较分析毒力频率和无毒基因存在频率，发现毒力频率明显高于无毒基因缺失的频率。其原因可能是这些无毒基因还发生除缺失之外的其他突变，如点突变、小片段缺失和TE 插入等[30]。本研究通过对部分菌株中Avr-Pib、Avr-Pik、Avr-Pita、Avr-Pi9 和Avr-Piz-t的PCR 产物进行测序比对，发现这些基因均发生了不同形式的突变。其中，Avr-Pik 和Avr-Pita 主要是在编码区发生了非同义突变，而Avr-Pib 则是在启动子靠近起始密码子的位置发生了碱基的缺失、替换和插入。

本研究与前人的研究结果均表明，利用鉴定品种进行致病性分析或者通过无毒基因检测分析的方法检测稻瘟菌群体无毒基因分布均存在一定的优缺点：利用鉴别品种可以直观地评价稻瘟菌株中是否携带对应的无毒基因，但是无法明确突变无毒基因的突变方式；通过检测已克隆无毒基因序列，可以体现无毒基因的变异方式，但是仅限于已克隆无毒基因，而且，对于受表观沉默的无毒基因则束手无策[31]。此外，菌株中还可能存在干扰无毒基因和R 基因互作的因子[32]。因此，结合2 种方法是当前检测和分析无毒基因变异情况的最佳方案。

综上所述，本研究利用24 个单基因水稻品种对福建省3 个水稻栽培地区采集的113 个稻瘟菌单孢菌株进行致病性分析，统计了3 个地区菌株的致病频率、毒力频率、无毒基因的存在频率、无毒基因的组合频率。同时检测了3 个地区稻瘟菌株中已克隆无毒基因的组成和变异情况。结果表明，携带Pik^s、Pib、Pi3 和Pi12 的水稻不适合在福建种植；携带Pia、Pii、Piz、Pita、Pit、Pis^h、Pi5、Pi7、Pi19、Pi20、Pita²和Pi11 的水稻不适合在建阳和宁化种植。而携带Pi1、Piz⁵、Pi9 和Pik、Pik^h、Pik^m位點的水稻品种仍适合在福建种植。根据周江鸿等[33]2003 年对福建省稻瘟病菌的毒力分析，未发现对抗性基因Piz 有毒力的菌株，而目前福建这3 个地区对Piz、Piz^t、Pib、Pi3、Pi9、Pi12，以及建阳和宁化地区对Pi5、Pi7 有毒力的菌株毒力频率呈上升趋势，而3 个地区对Pis^h、Pik^m的毒力频率呈下降趋势。对比本实验室2003 年的检测结果[34]，发现上杭地区稻瘟菌群体对Pi1 的毒力频率呈下降趋势，而建阳和宁化地区的毒力频率却呈上升趋势。同样，通过与杨秀娟等[13]2007 年检测的结果进行比较，发现福建这3 个地区稻瘟菌群体菌株对Pik^p和Pik^m的毒力频率呈下降趋势，而建阳和宁化稻瘟菌株对Pik、Pik^m、Pik^h、Pi1 和Piz⁵的毒力频率均呈上升趋势。对比杜新宜等[4]2016 年的结果发现，3 个地区稻瘟菌群体菌株对Pia，以及宁化、上杭地区稻瘟菌株对Pish 的毒力频率呈下降趋势，而对Pii、Piz⁵、Piz^t、Pita、Pib、Pi7、Pi11 的毒力频率均呈上升趋势。以上结果表明在过去的十几年间，福建稻瘟菌群体无毒基因组成存在一定的波动，并且不同地区的变化趋势也有差异。因此，对福建地区稻瘟菌群体无毒基因组成进行持续的检测仍具有重要的意义。