磷酸化调节的膜蛋白结构及其功能研究进展

孙夫德 任美娜 赵丽娜 马子祎 鲍宇

摘要 磷酸化修饰是膜蛋白翻译后修饰的重要类型之一，由蛋白激酶和磷酸酶共同調节而保持一种动态平衡，在正常生命活动乃至肿瘤发生中发挥调控作用。磷酸化修饰诱导膜蛋白结构变化可调节蛋白之间结合活力，而关键磷酸化位点突变可破坏蛋白结合并解除相关信号传导的调节。与其他蛋白不同，膜蛋白需要以质膜为介质发挥功能作用，由于膜组成复杂性和不对称性，磷酸化修饰对膜蛋白的质膜定位以及表面贴附至关重要。膜蛋白磷酸化还调节周围磷脂分子的热力学性质和动力学特性，从而加剧对磷脂双分子层有序度的影响。本文重点阐述了膜蛋白磷酸化的分子特征及调控机制，包括磷酸化位点分布，磷酸化修饰对膜蛋白结构调控以及特异膜环境依赖性；系统总结了膜蛋白磷酸化引发的结构变化在各种生物过程中的功能作用，旨在为膜蛋白磷酸化及相关靶向干预研究提供参考。

关 键 词 磷酸化修饰；膜蛋白；质膜；结构变化；生物功能

中图分类号 Q6     文献标志码 A

Structure and function of membrane proteins modulated by phosphorylation

SUN Fude， REN Meina， ZHAO Lina， MA Ziyi， BAO Yu

（Key Laboratory of Molecular Biophysics， Hebei Province， Institute of Biophysics， School of Sciences， Hebei University of Technology， Tianjin 300401， China ）

Abstract Phosphorylation modification is one of the main type of post-translational modification of membrane proteins. It is regulated by protein kinases and phosphatases to maintain a dynamic balance and play a role in normal life activities and even tumorigenesis. Phosphorylation induces structural changes in membrane proteins that regulate binding activity between proteins. Due to disease mutations， loss of phosphorylation sites may disrupt protein binding and deregulate signal transduction. Different from other proteins， membrane proteins require the plasma membrane as a medium to function. Because membrane composition is complex and asymmetrical， phosphorylation is crucial for the correct localization of membrane proteins. Phosphorylation of membrane proteins also greatly affects the thermodynamic and dynamics properties of the surrounding phospholipid molecules， which intensifies the influence on the order degree of the phospholipid bilayer. This paper focuses on the molecular characteristics and regulation mechanism of membrane protein phosphorylation， including the distribution of phosphorylation sites， the regulation of membrane protein structure and the dependence of phosphorylation on specific membrane environment. The functional roles of membrane protein phosphorylation induced structural changes in various biological processes were systematically summarized in order to provide theoretical references for a further study of membrane protein phosphorylation and relevant targeted intervention.

Key words phosphorylation modification; membrane protein; plasmolemma; structural change; biological function

0 引言

膜蛋白是一类能够结合或整合到细胞膜或细胞器膜上蛋白质的总称。在围绕细胞和较小细胞区室的脂质膜层中发现了数百万种膜蛋白，占所有编码蛋白质的25%～30%。根据与膜结合强度以及位置的不同膜蛋白被归为3类：外周膜蛋白、整合膜蛋白和脂锚定蛋白[1-2]。膜蛋白可以通过细胞外和细胞内的相互作用介导细胞与环境间物质及信号交换过程，如细胞信号传导、膜不透性分子转运和细胞间通讯等[3]。近年来，结构生物学的发展促使更多哺乳动物细胞膜蛋白的结构信息和生物关联性得以良好表征，且有广泛研究显示，膜蛋白在癌细胞发生发展中扮演重要调节作用[4]。同时，膜蛋白还是十分重要的药物靶标，目前所有可用药物中有70%以上是通过膜蛋白起作用的，其中包括治疗癌症、心脏病和疼痛的药物[5-6]。膜蛋白生物功能的充分发挥，大多需要由蛋白激酶和磷酸酶催化的可逆磷酸化修饰介导下的动态构象变化、配体结合以及亚细胞定位过程[7]。

磷酸化是一种生物体内重要的可逆性翻译后修饰。人类基因组编码的21 000种蛋白质中，超过三分之二被磷酸化，超过90%的蛋白会受到这种翻译后修饰的影响[8]。这种可逆机制分别通过蛋白激酶（protein kinase）和蛋白磷酸酶（protein phosphatase）催化发生。在蛋白激酶催化下，三磷酸腺苷（ATP）的磷酸基被转移至膜蛋白的氨基酸侧链而发生磷酸化修饰，随后磷酸化膜蛋白与下游磷酸化结合蛋白（phospho-binding proteins）相互作用。同时，磷酸化膜蛋白也可以在磷酸酶作用下发生去磷酸化（图1）。目前已知可发生磷酸化修饰的天然氨基酸有9种（丝氨酸Ser、苏氨酸Thr、酪氨酸Tyr、赖氨酸Lys、精氨酸Arg、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、半胱氨酸Cys和组氨酸His），而其中丝氨酸磷酸化、苏氨酸磷酸化以及酪氨酸磷酸化尤为常见[9]。在各种氨基酸的极性基团侧链上添加或移除磷酸基团通常都会造成蛋白局域电荷变化，这是磷酸化影响蛋白结构性质、稳定性和动力学的重要原因[10]。磷酸化修饰对蛋白的调节机制是多样的，磷酸化会使蛋白复合物不稳定，并可导致蛋白激活或失活。在其他诱导因素存在条件下，可介导异源蛋白复合物的形成，并通过蛋白类似物竞争性结合提供一种负调控机制。磷酸化还可通过诱导蛋白构象变化或蛋白之间结合的变构效应，调节蛋白间相互作用的性质和强度，从而协调不同的细胞反应途径[11]。

除了直接影响蛋白质本身的动力学特性外，膜蛋白的不同磷酸化模式似乎具有不同的“磷酸化条形码”，可以诱导配体呈现独特的构象及活性，从而控制不同的细胞反应。典型的膜蛋白是G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptor，GPCR），它可在C端和胞内环的多个残基位点发生磷酸化，不同位点磷酸化可特异性地调控其配体β-抑制素的活性状态，使下游信号蛋白的募集受到影响[12]。与水溶蛋白不同，膜蛋白磷酸化还会使其周围磷脂分子的热力学性质和动力学结构受到较大干扰，从而加剧对磷脂双分子层有序度的影响。磷酸化后的负电荷排斥某些负电性磷脂分子，使膜表面磷脂分子的分布发生改变。值得注意的是，磷脂分子的分布状态对生物膜的自组织结构、蛋白质-磷脂膜的相互作用、生物膜的融合分裂以及脂筏（lipid raft）的形成等具有重要的意义[13-14]。同时，磷酸化影响膜蛋白在细胞上形成团簇的形式以及在细胞膜上的结合取向，这种影响还与细胞膜本身的流动性有关[15]。大量报道显示膜蛋白的磷酸化修饰参与了细胞癌化过程，且其修饰位点变化通常与癌症患者的愈后相关[16]。因此，膜蛋白的磷酸化修饰可作为重要的愈后标志物，在肿瘤的治疗及愈后评估具有重要价值。本文将重点阐述膜蛋白磷酸化的分子特征及调控，系统总结膜蛋白磷酸化的结构变化在各种生理病理过程中的功能作用，旨为膜蛋白磷酸化深入研究提供理论参考。

1 膜蛋白磷酸化修饰的特征及调控机制

膜蛋白的多种氨基酸都可以被磷酸化，但丝氨酸（86.4%）、苏氨酸（11.86%）和酪氨酸（1.8%）残基是最常见的磷酸化位点[9]。膜蛋白磷酸化发挥特定功能调控具有位点依赖性，这意味着磷酸化发生不是随机的[17]。此外，不同位点的磷酸化修饰会调控膜蛋白的结构转变，而磷酸化修饰引发的结构变化在翻译后修饰中占比最高。对不同磷酸化修饰位点分析，揭示了其对膜蛋白结构影响的多样性和异质性，磷酸化可以在局部和全局水平上影响膜蛋白结构[18]。

1.1 磷酸化区域界面及结构特性

许多细胞功能调控机制在蛋白质-蛋白质相互作用水平上运作，相关信号通路涉及蛋白质-蛋白质结合活性和磷酸化修饰下的作用网络[19]。磷酸化修饰在某些情况下会调节膜蛋白同源寡聚和异源寡聚复合物中构象间或寡聚状态间的转变[20]。Nishi等[21]通过实验将磷酸化位点映射到人类同源或异源蛋白寡聚體的晶体结构。结果表明，与非结合界面的蛋白表面位点相比，磷酸化位点倾向于分布在瞬时同源低聚物和异源低聚物的结合界面上。有研究指出，异源寡聚体结合界面上的磷酸化位点取代所产生的结合亲和力变化更大，磷酸化可能直接调节结合界面上相互作用的强度。在界面上，磷酸化位点通过比非磷酸化位点形成更多的氢键和残基接触来促进复合物的稳定性。保持蛋白复合物结构完整性所必须的残基被称为结合热点，基于磷酸化位点经常靶向结合热点的观察结果，可知磷酸化位点和结合热点之间存在显著关联[22]。磷酸化可以提供膜蛋白间识别模式的多样性，从而增加膜蛋白结合的选择性[23]。界面上的磷酸化可以调节蛋白质与蛋白质之间的相互作用，这一调控功能与磷酸化位点倾向于位于蛋白寡聚体结合界面密切相关。

膜蛋白的N端和C端结构域在自然条件下多数是无序的，即它们不包含或很少包含明确定义的结构[24]。第一个系统性研究是对大量无序区域与实验已知磷酸化蛋白质进行的亲和力表征。该研究发现，本质上无序的区域更富集磷酸化位点[25]。磷酸化位点和无序膜蛋白质区域之间在序列复杂性、氨基酸组成、灵活性参数和其他特性具有一定的相似性。与有序界面残基（8%）或无序非界面残基（18%）相比，无序界面残基的磷酸化位点（25%）比例更高，这表明磷酸化与无序界面残基之间存在很强的关联。无序界面中磷酸化的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸比例分别为59%、26%、15%。磷酸化的酪氨酸更倾向分布在结构区域，而丝氨酸和苏氨酸则常出现在无序灵活的区域[10，26]。一些关于p53[27]、囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）[28]、p27[29]和其它膜蛋白[30]的实验研究表明，无序区域通常包含磷酸化位点，同时（去）磷酸化修饰可以与膜蛋白结构无序-有序的转变相耦合。预测完全无序蛋白质中的磷酸化位点比有序蛋白质中的磷酸化位点多10倍以上，这有力地支持了蛋白质磷酸化与无序结构之间紧密联系的观点。

1.2 磷酸化诱导的膜蛋白结构转变机制

最近越来越多的证据表明，细胞表面膜蛋白的结构更具动态性，并且在不同时间尺度上以平衡的方式在多个构象之间相互转换，例如活性和非活性构象间的动态转变[31]。值得注意的是，磷酸化翻译后修饰能够多方位多角度地影响调控膜蛋白的结构性质[32-33]。

1.2.1 磷酸化修饰通过氢键和盐桥调控膜蛋白结构

磷酸化基团在生理条件下是二价负电性的，可以与相同或不同链的相邻残基形成氢键和盐桥。磷酸基与其他残基之间最常见的作用模式是磷酸氧和精氨酸或赖氨酸侧链之间形成氢键和盐桥[34]。利用分子动力学模拟研究的结果显示，磷酸化导致众多膜蛋白结构发生封闭到开放的转变，关键氢键和新形成的盐桥是这些结构波动的潜在驱动因素[35-37]。Src蛋白酪氨酸激酶β3的赖氨酸（Lys298）与相邻αC螺旋的谷氨酸（Glu313）之间盐桥的形成是从自抑制状态到激活状态转换的先决条件[38]。磷酸化丝氨酸氢键受体比磷酸化天冬氨酸受体形成更稳定的相互作用，氢键的强度一般取决于磷酸质子化状态，质子化状态对磷酸化天冬氨酸的影响比对磷酸化丝氨酸的影响更明显[39]。磷酸化残基通常与带正电荷的侧链形成盐桥，盐桥的能量依赖于参与的侧链间的距离和取向[40]。综上所述，在膜蛋白中添加或去除二价负电性磷酸基可能会显著改变其局部的物理化学性质，并影响其稳定性和动力学属性。

1.2.2 磷酸化修饰在局部和整体水平影响膜蛋白结构

对不同膜蛋白磷酸化分析，揭示了其對蛋白质结构影响的多样性和异质性，磷酸化可以在局部和全局水平上影响膜蛋白结构[41-42]。我们通过粗粒化分子动力学模拟研究跨膜蛋白CD44（Cluster-of-Differentiation-44）胞质结构域2个保守位点丝氨酸Ser291和Ser325的磷酸化，发现Ser291的磷酸化使胞质结构域呈折叠构象，而Ser325磷酸化时胞质结构域整体表现为更延展的构象。2个磷酸化位点对CD44局部延展性调控的差异，将进一步影响下游细胞骨架结合蛋白ERM（Ezrin， Radixin and Moesin）与CD44的结合，这一发现强调了磷酸化对膜蛋白局部到整体的影响[43]（图2）。一项研究大规模比较了磷酸化和非磷酸化的蛋白质结构信息，并表明磷酸化产生了局部和整体的结构变化[44]。然而，只有13%的蛋白质在磷酸化和非磷酸化形式之间表现出大于2?的全局变化，磷酸化通过将整体构象异质性降低25%来稳定蛋白结构。有人认为磷酸化在许多情况下可能会限制膜蛋白单体的构象灵活性[45]。

1.2.3 磷酸化修饰诱导膜蛋白失活—活性状态转变

磷酸化可诱导具有不同活性或结合特异性的蛋白构象之间动态转变，从而导致蛋白质的激活或失活[46]。膜蛋白失活—活性结构的转变对于下游结合蛋白的细胞应答具有重要意义。CFTR是ABC超家族中的一种跨膜阴离子通道，CFTR活性具有PKA依赖性，主要归因于其胞质区未磷酸化的调节结构域（Regulatory domain，RD）对通道门控的抑制影响，RD结构域磷酸化可打开阴离子孔，因此磷酸化会使得这种抑制作用得以缓解[47]。数据显示阳离子钾通道结构和功能的动态可逆变化也是主要通过通道复合物的磷酸化翻译后修饰而实现的[48]。对于CD44而言，Ser291磷酸化使得CD44的CTD与内膜贴附，呈更卷缩的构象，此构象会掩盖CTD与ERM的N端活性域FERM（N-terminal subdomain of ezrin-radixin-moesin）的结合位点，进而通过抑制CD44-FERM复合物的形成来抑制细胞增殖。S325磷酸化使CTD远离内膜且呈延展构象，进而促进CD44与FERM的相互作用（图2）。整合素特定位点的磷酸化在整合素活性的调节起着关键作用。最近的研究表明，如果整合素α链的磷酸化位点不含磷酸盐，那么β链就不能被磷酸化，整合素就不具活性。只有当两条链都被磷酸化时，整合素的细胞质部分区域打开，与高亲和力的接头蛋白结合，导致丝蛋白被释放[49]。

1.3 特异膜环境依赖性

由于细胞膜组分的多样性以及结构的非对称性，膜蛋白在行使功能的过程中受细胞膜环境的密切调控。细胞膜生物物理特性，如膜厚度、流动性和表面电荷，同样也潜在地影响着蛋白的翻译后修饰，如棕榈酰化，磷酸化和糖基化等[13]。磷酸化诱导膜蛋白的拓扑结构变化受脂质环境的影响，尤其细胞膜内小叶富含的负电性磷脂分子是磷酸化修饰引发蛋白结构转变的重要因素。

目前研究最广泛的负电磷脂分子是棕榈油酰磷脂酰丝氨酸（palmitoyloleoyl-phosphatidylserine， POPS）和4，5二磷酸-磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol-4，5-biphosphate， PIP2）。POPS与PIP2虽同为仅存在于细胞膜内叶的负电性脂质，但PIP2同样担任第二信使作用，在蛋白聚集和易位过程中发挥着更为特殊的功能[50-51]。Ezrin蛋白的Thr567磷酸化已被证明在其构象激活中起重要作用，但Ezrin N端与PIP2的相互作用是Thr567磷酸化的必要条件。通过分析Erzin N端与PIP2极性头部复合物的晶体结构，发现Ezrin与PIP2的相互作用诱导了构象重排，从而实现Thr567位点的磷酸化[52]。钙调蛋白CaM的Thr79位于PIP2结合位点附近，通过酪蛋白激酶2（CK2）磷酸化的Thr79可以显著降低PIP2对其结合位点的亲和力，增强PIP2对SK（small conductance Ca2+-activated potassium channels）通道的抑制作用。Thr79磷酸化不会影响蛋白整体的构象，但显著改变了PIP2结合位点周围氨基酸残基之间的动态相互作用，例如形成新的盐桥，导致PIP2与其结合位点之间的相互作用被减弱[53]。

随着膜结构与功能研究的深入，脂筏的发现丰富了脂质膜对蛋白结构和功能的调控机制。脂筏是指膜脂双分子层中富含鞘脂类和胆固醇的微区，不同脂质和蛋白质之间亲和力差异导致膜域相分离，即形成脂筏（有序相）和非脂筏（无序相）结构域[54]。PIP2由于sn-2脂酰链的高不饱和度倾向分布在非脂筏域中，导致蛋白的膜区分配以及募集差异性[50，55]。脂筏结构域对磷酸化修饰调控影响的一个典型案例是低密度脂蛋白受体相关蛋白6（low density lipoprotein receptor related protein 6，LRP6），它与磷酸激酶同时定位至脂筏结构域，对于随后磷酸化修饰的发生和下游的信号传导至关重要。研究显示，当模型中脂筏数量明显超过通路特异性膜蛋白的数量时，LRP6磷酸化及下游通路活性显着降低[56]。磷酸化修饰以特异膜环境依赖性方式调控膜蛋白功能的机制，扩大了我们对膜脂分子在膜蛋白磷酸化修饰的建立和维持中所起作用的认识。

2 膜蛋白磷酸化的生物功能及意义

膜蛋白磷酸化是协调细胞和机体功能的初始步骤之一，如调节代谢、增殖、凋亡、炎症、亚细胞运输和其它重要的生理过程[57]。膜蛋白的生物活性与其分子结构相关，磷酸化修饰调控的结构转变是膜蛋白参与调节多种生物过程的重要方式，是介导细胞信号转导和细胞内功能最常见的作用机制之一[58]。细胞粘附蛋白是最典型的膜蛋白之一，参与细胞增殖和迁移，与癌细胞的恶性增殖侵袭密切相关。表1列举了目前研究比较清楚的细胞表面粘附蛋白磷酸化修饰参与调控的细胞生物功能。目前，有關膜蛋白磷酸化结构变化介导的生物功能研究主要集中在蛋白相互作用、信号转导和质膜定位等方面。

2.1 膜蛋白互作的分子开关

在特定的激酶和磷酸酶作用下，许多膜蛋白通过磷酸化/去磷酸化修饰被激活或失活。磷酸化诱导的结构变化作为分子开关，控制不同途径中的蛋白质活性以及与其它蛋白的结合模式，并调控细胞粘附、增殖和细胞免疫应答等[69-71]。目前，一些新的研究使用生物物理、结构和计算方法解释了磷酸化修饰在蛋白互作中的调节机制，为膜蛋白变构机制提供了新见解，并为磷酸化修饰调节剂的开发提供了新机会。

我们利用高通量Martini粗粒化分子动力学模拟研究了在多种细胞类型中广泛表达的Ⅰ型跨膜蛋白CD44，从非活性、低亲和状态到活性、高亲和状态的转变需要胞质结构域特定丝氨酸残基的磷酸化修饰[72]。Ser291和Ser325磷酸化使CD44胞质结构域形成封闭或开放构象，这两种构象的选择作为一种分子开关调控CD44与下游细胞骨架结合蛋白（α-actin）结合（图2）。同样在细胞极性发挥关键作用的Ⅰ型跨膜蛋白Crumbs，其胞质结构域Thr2118的磷酸化通过防止FERM结合基序β-折叠构象的形成，进而阻止Crumbs胞质结构域与FERM的结合[73]。在蛋白激酶C（PKC）和Rho激酶作用下，细胞骨架结合蛋白FERM-Moesin胞质结构域C端的Thr558残基发生磷酸化（图2），破坏了N端和C端之间的自抑制结合，从而使N端能够与CD44或其他粘附蛋白相互作用，这与细胞-细胞和细胞-细胞基质粘附的形成和分解有关[74]。磷酸化修饰膜蛋白的结构在细胞效应过程的响应和启动起着重要作用。磷酸化小分子GTP结合蛋白Rab（Ras genes from rat brain）与其效应器相互作用的影响也已在结构生物学的背景下进行了研究。Rab蛋白高度保守的开关Ⅱ区域磷酸化诱导的结构变化对Rab与其调节蛋白及效应蛋白之间的相互作用具有抑制作用，从而决定相关生物调节途径[75]。该研究表明，Rab的调节功能可能通过动态的磷酸化实现，而不仅仅是与调节蛋白结合。

2.2 调控细胞信号通路

磷酸化介导的信号转导依赖蛋白多种功能构象之间的精确转换。膜蛋白的磷酸化修饰调节多种细胞信号途径，精确控制磷酸化诱导的构象状态对于维持细胞稳态至关重要[76-77]。

磷酸化修饰对膜蛋白的调控机制在各种细胞信号通路中发挥作用，蛋白激酶催化翻译后磷酸化修饰，同时许多激酶本身受磷酸化调控，这导致复杂的信号传导和调控网络[78]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一种已知的参与磷酸化修饰级联效应激活信号通路的蛋白，MAPK的活性被认为是由活化环的氨基酸序列TxY中的双磷酸化位点所调控，这些位点的双磷酸化使MAPK的活性增加一千倍以上[79-80]。抑制素β-arrestin与磷酸化GPCR的结合控制着细胞信号传导的多个环节。最近，分子动力学模拟和氨基酸位点突变研究发现，不同的GPCR磷酸化位点匹配不同的抑制蛋白结构[81]，不同匹配模式决定具体的信号传导途径（图3）。蛋白质-蛋白质界面的磷酸化修饰是一种广泛存在的现象，在调节多种信号级联传导中发挥着重要作用。微囊蛋白（caveolin-1）Tyr14的磷酸化参与整合素调节的细胞表面穴样内陷（caveolae）以及迁移细胞中粘着斑处的信号传导[82]。对磷酸化修饰介导的信号通路研究，以及通过分子模拟或者结构生物学可视化磷酸化膜蛋白特异构象调控信号通路的机制，潜在具有重大临床治疗用途，特别是因为某些信号蛋白磷酸化异常修饰直接影响的癌细胞生存和侵袭。

2.3 介导膜蛋白的质膜定位

膜蛋白的质膜定位对基本信号传导和物质转运过程至关重要，而它们的异常定位往往导致严重的疾病症状或发育缺陷[83-84]。膜蛋白的亚细胞定位是由翻译后修饰动态调节的，磷酸化修饰通过可逆性和快速动力学实现对膜蛋白质膜定位的动态调节，主要发生在受体蛋白上具有分拣信号功能的胞质结构域。膜蛋白磷酸化修饰由于磷酸基负电荷的引入还会影响其周围磷脂分子的分布状态，进而调控脂质双分子层的流动性。磷脂分子的分布状态对于膜蛋白的质膜定位，以及与磷脂的相互作用具有重要意义[13，32，85]。下文将引用相关研究阐述膜蛋白磷酸化对其质膜定位的影响及生物功能调控。

Kristyna通过全原子动力学模拟对磷酸化和酸性脂质如何影响GPCR成员β-肾上腺素（β2AR）的结构和动力学进行了研究[81]，结果显示，位于胞内环（ICL3）Ser246、Ser261和Ser262残基的磷酸化，可驱动ICL3释放至细胞质与抑制素相互作用，但缺乏酸性脂质的环境会逆转磷酸化调控作用（图3）。这一研究结果表明，受体磷酸化和膜环境协同调节GPCR介导的信号转导。在K-Ras4B的C末端高变多碱基区域发现了PKC依赖性的Ser181磷酸化。高变区赖氨酸Lys侧链的正电性铵（RNH3+）与Ser181磷酸化后形成的负电性氧之间形成氢键，导致C端与质膜结合不稳定，增加了质膜的解离速率，诱导该蛋白从质膜快速易位到内膜，包括内质网和线粒体膜，使磷酸化的K-Ras与线粒体外膜上的Bcl-xL相互作用，参与细胞死亡调控[86-87]。磷酸化修饰还会导致K-Ras4B更依赖于膜的流动性环境，即更无序的脂质，以实现有效的膜分配[88]。磷酸化Ser367可能驱动L-selectin胞质尾从质膜内叶解吸附，以增强ERM的结合[66]。脂筏膜环境及脂筏相关蛋白内收蛋白β（β-adducin）在β2整联蛋白介导的中性粒细胞迁移过程中起到重要的作用。通过免疫沉淀、免疫印迹等实验发现，β-adducin与脂筏结构的共定位是通过β-adducin分子上的酪氨酸残基磷酸化调控的[89]。

2.4 参与肿瘤调控及靶向干预

磷酸化修饰对膜蛋白的生物功能影响非常广泛，不仅调控膜蛋白自身或配体的结构变化，介导膜蛋白的内在活性，还可通过质膜定位和复合物形成影响细胞信号传导。磷酸化是参与调节激酶表达最常见的翻译后修饰，磷酸化位点突变可导致激酶信号通路的异常激活或失调，这是多种肿瘤发生的基础，使用激酶抑制剂对于肿瘤治疗具有重要价值[90]。目前，许多激酶抑制剂已成功用于治疗乳腺癌、慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病和非小细胞肺癌[91]。因此，分析蛋白质磷酸化和相关酶活性已成为癌症治疗中的重要内容。有研究通过质谱多反应监测（MRM）技术，揭示了表皮生长因子（EGF）联合吉非替尼诱导表皮生长因子受体（EGFR）S1166位点磷酸化，能够明显抑制肺癌细胞的生长增殖，该研究有效地证明了通过磷酸化位点实现肺癌靶向治疗的可能[92]。随着靶向质谱分析技术的进步，磷酸化蛋白还可作为神经系统疾病的潜在生物标志物，根据磷酸化程度描述疾病状态[93]。例如，高分子量神经丝蛋白磷酸化用于表征克雅氏症的病理状态[94]；酸性富脯蛋白和组胺素可作为自闭症的标志物[95]。从阿尔兹海默症患者脑中提取的Tau蛋白发现其磷酸化程度明显增加，因此，大多靶向Tau治疗阿尔兹海默症的方法旨在抑制“病理诱导”激酶或靶向病理磷酸化位点[96]。基于磷酸化介导膜蛋白功能表达以及靶向阻断磷酸化引发的病理通路研究，具有重要的临床治疗用途。

3 总结及展望

膜蛋白磷酸化修饰的物理化学效应非常多样，本文依据最近的实验和计算模拟研究回顾了磷酸化修饰膜蛋白的分子基础和研究现状，阐述了磷酸化调控膜蛋白结构的主要机制，包括磷酸化基团参与膜蛋白氢键网络和盐桥的形成或破坏，局部和整体水平对膜蛋白结构的调控，以及磷酸化修饰诱导膜蛋白失活–活性构象转变。研究表明，磷酸化膜蛋白的结构与其生物功能的正常发挥以及细胞稳态的维持息息相关。其介导的生物功能主要包括：磷酸化诱导的结构变化会作为分子开关，控制不同生物反应中的膜蛋白活性，进而影响与其它蛋白的结合模式；磷酸化修饰诱导构象的精确转换直接影响膜蛋白下游信号转导途径的选择；磷酸化修饰影响膜蛋白在质膜上的准确定位，磷酸化和天然酸性脂质协同调节膜蛋白的结构和动力学等其它生理过程。翻译后磷酸化修饰是膜蛋白功能调控的重要方式，其调控形式极其多样，与诸多疾病密切相关。越来越多的证据表明膜蛋白磷酸化修饰位点的异常表达与肿瘤的代谢调控之间存在密切联系[97]，这为肿瘤发生发展的机制研究和靶向治疗领域提供了一系列有价值的创新性研究思路。

在过去的十年，越来越多的整合膜蛋白结构已通过X射线、核磁共振及冷冻结晶等手段进行揭示[98-100]，极大地提升了我们对整合膜受体信号传递过程的理解水平。然而，晶体结构代表晶格中靶蛋白的静态快照，观察到的构象可能不是脂质双层中的主要状态。由于膜蛋白所处位置的特殊性，传统生物技术实验也很难排除周围脂质的干扰，探究磷酸化调控膜蛋白结构动态变化还存在一定的挑战。计算模拟研究在阐明磷酸化修饰的原理和机制方面发挥核心作用，有助于弥合磷酸化膜蛋白结构与磷酸化修饰膜蛋白功能之间的差距[101-103]。使用计算机策略来研究膜蛋白结构，使我们能够进一步理解膜蛋白如何执行其不同的功能，同时帮助开发新的预测工具探测特征的折叠[104]。人们曾多次尝试预测由磷酸化或去磷酸化事件引起的结构重排，这种分析可以确定控制磷酸化和非磷酸化状态之间转变的潜在机制[105]。尽管目前已有大量与翻译后磷酸化修饰相关的研究，但在大多数情况下，磷酸化的特定位点在膜蛋白功能中发挥的具体作用知之甚少。获得的结构信息有限，部分原因是磷酸化等翻译后修饰的存在，蛋白特性也可能存在潜在的异质性。在不同时空条件下，磷酸化修饰如何诱导其他膜蛋白的构象变化，如何影响膜蛋白与配体分子的相互作用，如何选择性的调控下游细胞效应应答等作用机制，对于发现基于磷酸化修饰的普适性调控机制具有重要意义。距离完全理解内在的分子机制还有很长的路要走，探究各种类型膜蛋白的磷酸化调控机制将会长期作为翻译后修饰研究領域的重点。

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