牛樟叶总多糖提取物减轻衰老小鼠认知障碍的作用研究

张蓓 徐宏

【摘 要】 目的： 研究牛樟叶总多糖减轻衰老小鼠认知障碍的作用。方法：6月龄60只昆明小鼠，随机分为空白组、模型组、阳性组盐酸多奈哌齐片（0.3 mg/100 g）、牛樟叶总多糖提取物给药组（58 mg/100 g、46.4 mg/100 g、29 mg/100 g）。采用腹腔注射D-半乳糖方法制备衰老动物模型，连续注射给药40 d，于第11天开始给予相应剂量的药物，第36天进行Morris 水迷宫考察小鼠行为学实验，给药结束后，用水合氯醛麻醉后处死取材，采用酶标仪按试剂盒说明书检测脑匀浆丙二醛（MDA）水平、小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷光甘肽（GSH）水平、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），采用HE染色观察小鼠海马组织形态学改变情况。结果：与模型组相比，牛樟叶提取物各剂量组能不同程度降低小鼠脑匀浆中MDA水平，升高小鼠血清中SOD、GSH、GSH-Px水平，牛樟叶总多糖提取物组认知功能有所提高，与模型组比较，阳性药物组和牛樟叶总多糖各剂量组小鼠海马组织CA1区神经细胞排列较整齐，结构相对正常，核浓染和固缩的程度降低。结论：牛樟叶总多糖有一定的抗衰老减轻认知障碍的作用，作用机制可能与其抗氧化作用有关。

【关键词】 总多糖；抗衰老；认知障碍

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2023）09-0020-05

Abstract：Objective To study the effect of total polysaccharide from cinnamomum cinnamomum leaves on reducing cognitive impairment in aged mice.Methods Sixty Kunming mice aged 6 months were randomly divided into blank group， model group， positive group， donepezil hydrochloride tablet （0.3 mg/100 g）， and cinnamomum cinnamomum leaves polysaccharide extract administration groups （58 mg/100 g， 46.4 mg/100 g， 29 mg/100 g）. The aging animal model was prepared by intraperitoneal injection of D-galactose for 40 days. On the 11th day， the corresponding dose of the drug was given. On the 36th day， the Morris water maze experiment was conducted to investigate the behavior of the mice. The level of malondialdehyde （MDA） in brain homogenate， the level of superoxide dismutase （SOD）， glutamyl glycine （GSH） and glutathione peroxidase （GSH-Px） in serum of mice were detected by microplate plate according to the kit instruction. The morphological changes of hippocampus were observed by HE staining.Results Compared with the model group， each dose group of cinnamomum cinnamomum extract could reduce the level of MDA in rat brain homogenate to different degrees， and increase the levels of SOD， GSH and GSH-Px in serum of mice. The cognitive function of cinnamomum cinnamomum cinnamomum polysaccharide extract group was improved. The nerve cells in the hippocampal CA1 region of mice in the positive drug group and the total cinnamomum cinnamomum polysaccharide groups were arranged neatly and the structure was relatively normal， and the degree of nuclear hyperchromia and pyknosis were reduced. Conclusion Polysaccharide from Cinnamomum cinnamomum leaves has a certain anti-aging effect and alleviates cognitive impairment， and its mechanism may be related to its antioxidant effect.

Keywords：Total polysaccharide; Anti-aging; Cognitive Impairment

衰老分為生理性衰老以及病理性衰老，平常所说的衰老指的是生理性的衰老，是一种无法逆转的生理过程。衰老的表现形式多样，除了外在表现，大脑记忆能力的减退是衰老早期的表现之一［1］。机体的氧化应激程度是加剧衰老发生的重要原因之一，可推知具有抗氧化作用的药物，可能具备一定程度的抗衰老能力。

丙二醛是生物体中脂质过氧化的常见产物之一，在临床学科中，MDA是脂质过氧化的生物标记，可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度；SOD是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员；GSH能帮助保持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用；GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶［2-5］。本项目检测给药后小鼠脑浆及血清中上述因子的变化，以明确牛樟叶总多糖具备增强机体抗氧能力，从而起到延缓衰老作用。

此外，项目组前期已有实验研究表明牛樟叶水提取物的抗衰老作用［6］，为了进一步明确其发挥作用的物质基础，对水提取物中的多糖类成分进行了纯化富集实验，以纯化后的多糖提取物开展抗衰老作用研究，以期可揭开其抗衰老作用的物质基础，为牛樟叶的进一步开发奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 动物 实验动物KM小鼠60只，（20±2）g，清洁级，雄性，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002。动物饲养于温度（23±2） ℃、相对湿度60%～65%、12 h 明暗交替环境，分笼饲养，标准饲料，自由进食饮水。

1.2 药物 牛樟叶（Cinnamomum camphora leaves）总多糖提取物（25 mg/mL ，批号：20201221，柳州市中医医院中药壮瑶药制剂研发重点实验室）

1.3 试剂 盐酸多奈哌齐片（卫材（中国）药业有限公司，批号：20200818），D-半乳糖（惠兴生化有限公司，批号：120214）。MDA试剂盒（批号：20200213）、 SOD 试剂盒（批号：20190815）、GSH 试剂盒（批号：20190923）、GSH-Px 试剂盒（批号：20190414），以上试剂盒均购自南京建成生物研究所。

1.4 仪器 全波长酶标仪（Epoch Biotek 公司，美国）；ME204E分析电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］； UV1780-5 紫外分光光度计（岛津企业管理中国有限公司）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组给药 60只雄性小鼠适应性喂养1 W后，随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组及牛樟叶总多糖高、中、低剂量组，每组10只。

2.2 造模给药 造模方法参考文献［7］方法，模型组、阳性给药组、牛樟叶总多糖各给药剂量组小鼠每日腹腔注射D-半乳糖生理盐水溶液2.5 mL/100 g，正常对照组注射同体积的生理盐水，从实验第11天开始，灌胃给予牛樟叶总多糖高、中、低剂量组（58.0 mg/100 g、46.4 mg/100 g、29.0 mg/100 g），根据预实验结果，3个剂量组小鼠血清SOD、GSH、GSH-Px指标差异有显著意义（P<0.05），加大给药剂量无统计学意义，故本次实验依据预实验的结果设置三个剂量组比例为2∶1.6∶1），阳性对照组给予盐酸多奈哌齐片（0.3 mg/100 g），正常对照组及模型组灌胃同体积的蒸留水，每7 d称体质量1次，依据体质量调整给药剂量，连续40 d。

2.3 行为学实验［8］ 从造模第36天开始进行连续5 d的定位航行实验，在水池中第Ⅱ象限的中心位置放置平台，每天依次在每个象限训练每只小鼠，若小鼠60 s内未能找到平台，则将小鼠引导至平台上，其潜伏期为60 s，完成逃避潜伏期实验。在末次定位航行实验结束24 h后进行1次空间探索实验，撤掉平台，随后将小鼠面向池壁放入水中，入水口选择平台对面的象限，时间为60 s，计算平台象限逗留时间（t3） 与总时间（t总）的比值（%） 。

2.4 小鼠血清的SOD、GSH-Px活性、GSH活性及脑组织匀浆中MDA含量检测 各组取8 只小鼠，水合氯醛麻醉后眼眶取血，4 ℃、3 000 r/min 离心15 min，取上层血清，采用酶标仪按SOD、GSH-Px、GSH、MDA检测试剂盒说明书检测GSH-Px、GSH活性及SOD、MDA含量。

2.5 小鼠海马组织病理学检查 水迷宫实验结束后，各组随机取3只小鼠，水合氯醛麻醉后开胸，暴露心脏，自左心室升主动脉灌注约50 mL生理盐水，待流出液为无色时，继以灌注4%多聚甲醛溶液约60 mL至小鼠全身变硬。灌注结束后，剖取小鼠全脑放入4%多聚甲醛溶液中固定，常规脱水、包埋、切片，蘇木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察海马组织CA1区神经细胞的形态及结构。

2.6 统计学方法 实验数据均采用SPSS 23.0 统计软件进行处理，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

1 牛樟叶总多糖提取物对小鼠行为学的影响

1.1 Morris 水迷宫行为学检测结果（表1） 各组小鼠逃避潜伏期随训练天数增加而逐渐缩短。与正常组比较，训练第5日时，模型组小鼠行动路线仍旧杂乱无章，逃避潜伏期时间明显延长（P<0.05），逗留平台象限时间（t3） 占总时间（t总） 的比值减少（P<0.05 ），穿越平台次数减少（P<0.05）；与模型组比较，给药组小鼠逃避潜伏期缩短（P<0.05 ），平台象限逗留时间占总时间的比值增加（P<0.05 ），穿越平台次数亦增加（P<0.05） 。

1.2 牛樟叶总多糖对衰老小鼠血清SOD、GSH、GSH-Px水平的影响

1.2.1 牛樟叶总多糖对衰老小鼠对血清SOD、GSH、GSH-Px水平的影响 与正常组相比，模型组血清SOD、GSH、GSH-Px显著降低（P<0.05）；与模型组相比，牛樟叶总多糖各剂量组和阳性组SOD、GSH、GSH-Px均显著升高（P<0.05），结果详见表2。

1.2.2 牛樟叶总多糖对衰老小鼠脑组织匀浆MDA水平的影响 与空白组相比，模型组MDA水平明显升高（P<0.05），与模型组相比，阳性给药组及各剂量给药组MDA明显降低（P<0.05），结果见表3。

1.3 牛樟叶总多糖对各组小鼠海马组织CA1区神经细胞形态学的影响 正常组小鼠海马组织CA1区神经细胞排列整齐，细胞形态完整、结构正常，细胞质丰富，细胞核与细胞质界限清晰可见、核仁明显；与正常组比较，模型组小鼠海马组织CA1区神经细胞核浓染、形态不规则，与模型组比较，牛樟叶总多糖各剂量组小鼠海马组织CA1区神经细胞排列较整齐，结构相对正常，核浓染和固缩的程度降低。这表明牛樟叶总多糖可有效改善D-半乳糖所致的衰老小鼠海马组织神经细胞受损，结果如图1所示。

4 讨论

随着社会向老龄化的趋势发展，对于抗衰老药物的需求量越来越大［9-11］，中草药多成分多靶点的优势在抗衰老作用上表现出强大的优势，大量的研究表明，中草药多糖类、黄酮类成分、皂苷类成分等有明显的抗衰老活性［12］。课题组前期的实验结果表明牛樟叶水提取物可延缓小鼠衰老进程，但是发挥作用的物质基础却未进一步研究。本文基于前期的实验基础，在水提取液的基础上，研究牛樟叶总多糖的纯化工艺，以最大程度富集牛樟叶总多糖成分。课题组采用纯化后的牛樟叶总多糖溶液进行灌胃给药，开展行为学、海马组织病理学检查及各细胞因子的检测实验，以进一步明确牛樟叶发挥抗衰老作用的有效成分及其作用机制。

由小鼠行为学实验结果可知，模型小鼠的逃避潜伏期时间明显延长、穿台次数明显减少，给予牛樟叶总多糖药物干预后，小鼠的上述指标较模型组均有显著改善，表明小鼠的学习记忆能力得到明显的提高。

机体衰老过程涉及许多内外因素，活性氧自由基（ROS）是在衰老过程中最常见的内源性生化因子，其能与生物膜中不饱和脂肪酸形成过氧化脂质，引起神经元的损伤，导致机体功能下降，产生记忆能力衰退等衰老症状［13］。机体相关抗氧化酶如SOD、GSH-Px、GSH等活性下降使机体清除自由基的能力下降，加速衰老进程［14］。由此可推知，抗衰老的能力在一定程度与抗氧化的能力有关，提高抗氧化能力，有利于延缓衰老［15］。

D-半乳糖诱导的衰老模型同时作为一种脑老化的模型日益得到认可［16］。本研究通过腹腔注射D-半乳糖建造衰老动物模型，从海马组织的病理检查结果可知，衰老模型小鼠的海马组织与正常对照组的形态学上有明显的差异，而给予牛樟叶多糖药物干预后，药物干预组的海马组织形态学与模型组相比也有明显的差异，这表明，通过D-半乳糖建造的动物模型可作为脑老化模型，而给予牛樟叶总多糖干预后，脑老化的程度有所减轻。

通过对各组小鼠血清SOD、GSH、GSH-Px以及脑组织匀浆MDA的检测结果可知，血清SOD、GSH、GSH-Px的活力，模型组与正常组相比，指标均下降（P＜0.05），牛樟叶总多糖各剂量药物干预组与模型组相比，指标均上升（P＜0.05），而脑组织匀浆MDA含量，模型组与正常组相比，指标均上升（P＜0.05），牛樟叶总多糖各剂量药物干预组与模型组相比，指标均下降（P＜0.05）。结果提示牛樟叶总多糖能升高D-半乳糖致衰老小鼠模型血清中SOD、GSH、GSH-Px水平，同时降低MDA的水平，在一定程度上提高了机体清除自由机的能力，削弱了脂质过氧化物对脑组织的损伤作用，从而达到抗衰老的目的。

本实验初步证实牛樟叶发挥抗衰老作用的活性成分为多糖类成分，而至于是哪一种多糖仍需进一步分离研究。通过对抗氧化酶活性及过氧化物产物MDA的含量检测结果可推测，牛樟叶多糖确能通过抗氧化作用降低脑内过氧化脂质的含量，起到脑组织的保护作用，进而延缓衰老的发生，至于是通过激活哪条通路发挥作用，有待课题组进一步研究。

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（收稿日期：2022-08-23 编辑：刘 斌）

基金项目：柳州市阳和工业新区应用技术研究开发与科技创新项目合同（2019007）。

作者简介：张蓓（1984—）女，汉族，硕士，副主任药师，硕士研究生导师，研究方向为中药品质评价及活性成分研究。E-mail：zhangbei8402@126.com