基于网络药理学及分子对接技术探讨PP2治疗骨性关节炎的作用机制

张浩 赵琦 李晓强 黄昊 李奕廷 刘佳

【摘要】 目的 基于网络药理学探究PP2对骨性关节炎（OA）的潜在治疗作用及具体机制。方法 从PharmMappe和Swiss target prediction在线数据库中收集PP2靶点，而致病性OA靶点则从GeneCards databases、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、PharmGkb、Therapeutic Target Database（TTD）、DrugBank 5个在线数据库中获得。通过VENNY在线工具找出PP2和OA的交集基因，通过基因分类学（gene ontology，GO）、京都基因和基因组百科全书 （Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，预测与PP2相关的潜在功能和信号通路。构建PP2的蛋白互作网络，以筛选出PP2的核心基因。通过分子对接模拟研究验证预测；通过大鼠软骨细胞中加不同浓度PP2（0，20 μM），然后进行qRT-PCR对差异基因进行验证。结果 PP2中的活性成分221个，与疾病共同靶基因为67个，其中筛选出核心靶基因15个。GO富集和KEGG通路富集中涉及MAPK信号通路、EGFR信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、JAK-STAT信号通路、AGE-RAGE信号通路和ErbB信号通路等多种信号通路。结论 PP2能够调节多种信号通路从而达到治疗OA的作用。其中mTOR、EGFR、SRC、MAPK8、PIK3CA、MAPK14、SDHA、EGF、CREBBP JAK1、CSNK2A2、ERBB2、PDGFRA、KIT和SOD2基因是值得关注的靶基因。MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路是主要调控通路。

【关键词】 骨性关节炎；网络药理学；PP2；MAPK信号通路；PI3K-Akt信号通路

中圖分类号：R684.3 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.05.004

【Abstract】 Objective To explore the potential therapeutic effect and mechanism of PP2 on osteoarthritis （OA） based on network pharmacology.Methods PP2 targets were collected from PharmMappe and Swiss target prediction online databases. However， pathogenic OA targets were obtained from 5 online databases， namely， GeneCards databases， Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM）， PharmGkb， Therapeutic Target Database （TTD） and DrugBank online databases. The intersection genes of PP2 and OA were found by VENNY online tool. And then， the potential functions and signal pathways related to PP2 were predicted by gene ontology （GO） and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） enrichment analysis. The protein interaction network of PP2 was constructed to screen the core genes of PP2. Then， the prediction was verified by molecular docking simulation. Different concentrations of PP2 （0， 20 μM） were added to rat chondrocytes， and then the differential genes were confirmed by qRT-PCR.Results There were 221 active components in PP2， and 67 shared common target genes with the disease， of which 15 core target genes were screened. GO enrichment and KFGG pathway enrichment involved many signal pathways， such as MAPK signal pathway， EGFR signal pathway， PI3K-Akt signal pathway， Ras signal pathway， Rap1 signal pathway， JAK-STAT signal pathway， AGE-RAGE signal pathway and ErbB signal pathway， etc.Conclusion PP2 can regulate various signal pathways to achieve therapeutic effects on OA. mTOR， EGFR， SRC， MAPK8， PIK3CA， MAPK14， SDHA， EGF， CREBBP JAK1， CSNK2A2， ERBB2， PDGFRA， KIT and SOD2 genes are target genes which are worthy of attention. MAPK signalling pathway and PI3K-Akt signalling pathway are main regulatory pathways.

【Key words】 osteoarthritis （OA）; network pharmacology; PP2; MAPK signaling pathway; PI3K-Akt signaling pathway

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种能够严重影响患者生活质量的慢性退行性关节疾病，多见于中老年人，并随年龄增长其发病率也呈增长趋势［1］。尽管我们已经知道，在OA的发生发展过程中，多种因素对其有影响，如遗传、代谢、环境和创伤等［2］，但其具体的发病分子机制尚未有明确的阐述。近年来研究人员对OA发病的具体机制研究越来越多［3］，认为在OA的不同发病阶段可能存在多种致病机制［4］，但到目前为止还未找到有效的疾病治疗方法。

PP2是一种可逆的ATP竞争性Src家族激酶抑制剂，Lck和Fyn的IC50分别为4 nM和5 nM［5］。有报道表明PP2在抗肿瘤、抗氧化应激、抗炎等方面都具有一定作用［6-7］，并且能在多靶点上对疾病的发展产生影响［8-9］。PP2的这些效果表明，它可能在OA中发挥积极作用。但PP2对OA的具体治疗机制未有过报道，所以，为了弄清PP2与OA的相互作用靶点，并阐明其具体机制，有必要对其进行进一步探索。

网络药理学是一种新的药理学分析方法，能够研究药物的潜在靶点和相互作用［10］。因此在OA治疗药物的开发中发挥很大作用［11］。考虑到PP2可以通过多种靶点影响疾病进程，所以通过网络药理学研究PP2在OA中的潜在作用机制是非常有价值的。因此，本研究旨在通过网络药理学和大鼠软骨细胞，研究PP2对OA的影响，并探索其潜在机制，以便为了解PP2治疗OA和药物多靶点提供新的观点。

1 材料与方法

1.1 PP2和OA相关靶点的收集

利用PharmMappe（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）和Swiss target prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）在線数据库中收集PP2靶点［12］。先从PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中检索到PP2的2D结构，然后使用PharmMappe和Swiss Target Prediction database预测可能存在的靶点。OA相关靶基因从GeneCards databases（https：//www.genecards.org/）、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）（https：//omim.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）、Therapeutic Target Database（TTD）（https：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/） 5个数据库中收集。合并5个数据库并删除重复基因得到OA相关靶点。

1.2 候选靶点的确定

为了了解PP2的有关靶点和OA相关靶点之间的相互作用，使用jvenn（https：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html）在线工具，以获得PP2和OA的共同靶点，并绘制Venn图［13］和PP2治疗OA 的潜在靶点列表。

1.3 蛋白互作（PPI）网络构建

为了更好地了解PP2治疗OA的分子机制，将PP2和OA的共同靶点导入STRING11.5数据库（https：//cn.string-db.org/），构建PPI网络模型［14］。物种设置为人，置信度的最小交互阈值设定＞0.7，并将结果导入Cytoscape软件中，用以构建PPI网络，使用APP-CytoNCA评估PP2在治疗OA中的核心靶点。按介数中心性（Betweenness）值＞90归为核心靶点，同时将核心节点设为红色［15］。

1.4 GO和KEGG富集分析

使用R/Bioconductor clusterProfiler（版本4.2.1），基因分类学（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，对PP2和OA重叠基因进行功能注释和通路富集分析。富集GO项分为生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。

1.5 利用分子对接验证PP2与靶点的相互作用

通过分子对接模拟每个假定靶点与PP2相互作用来验证PP2与靶点的结合。确定小分子配体，先从PubChem数据库中检索出PP2的2D结构，使用ChemBio3D（版本14.0.0.117）将PP2的2D结构转化为3D结构。蛋白受体的准备，将预测的靶点基因输入PDB数据库（https：//www.rcsb.org/），下载基因蛋白PDB格式的三维结构，通过PyMOL（版本2.4.0）软件去除水分子和小分子配体，然后使用AutoDock工具（版本1.5.6）对其添加极性氢，同时将受体和配体都转化为PDBQT格式。使用AutoDock Vina软件（版本1.1.2）进行对接计算。对接结构中自由能最低的结构被认为是最佳对接构象，然后使用PyMOL（版本2.4.0）进行可视化。

1.6 SD大鼠软骨细胞的分离

超净台下取刚出生1～3天小鼠的肋软骨，剥离组织后加入胰酶37 ℃消化30 min，然后使用Ⅱ型胶原酶继续37 ℃消化过夜。第二天经100 μm滤网过滤后，在1000 rmb下离心5 min。软骨细胞在含10%FBS的F12培养基中培养。

1.7 定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）

用TRIzol试剂（Life Technologies）从软骨细胞中提取总RNA。使用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测量RNA浓度。总RNA（每个样本1 μg）使用 PrimeScriptTMRT-PCR kit （Takara，Shiga，Japan）根据制造商说明反转录为cDNA。反转录反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃冷却。随后使用SYBR-green试剂和适当的引物进行RT-PCR。PCR热循环条件为：95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40次循环。采用2-ΔΔCq方法进行比较定量评估。对于每个目标基因转录水平归一化为β-actin，并表示为相对于指示对照的折叠变化。qRT-PCR所用引物见表1。

1.8 Western blotting

软骨组织标本和软骨细胞在含有PMSF、蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Keygen）的RIPA裂解缓冲液中裂解。将蛋白与负载缓冲液混合，煮沸10 min，进行SDS-PAGE处理，然后转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶在TBST中封闭1 h后，用一抗检测印迹。用Western blot法测定靶蛋白collagen Ⅱ（1∶1000，ab188570，Abcam，USA），Aggrecan（1∶1000，ab36861，Abcam，USA），SOX9（1∶1000，A19710，ABclonal，China），ADAMTS5（1∶250，ab41037，Abcam，USA），MMP13（1∶1000，18165-1-Ap，Proteintech，China），MMP9（1∶1000，ab283575，Abcam，USA），GAPDH（1∶10000，ab181602，Abcam，USA）相对于对照GAPDH的表达水平。结合抗体用辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗体检测，用增强化学发光试剂观察。使用ImageJ软件对数据进行密度分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS（25.0版本，IBM公司）和Graph Prism Software（8.0版本，图棱镜软件公司）。两组样本的比较采用双向方差分析，然后采用Tukey检验。检验水准：α=0.05。

2 结 果

2.1 PP2活性成分和共同靶基因分析

从PubChem数据库中检索到PP2的2D结构（如图1A），将PP2的2D结构录入PharmMappe和Swiss target prediction在线数据库中，并收集PP2相关靶基因，共获得221个基因。OA相关靶基因从GeneCards databases、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、PharmGkb、Therapeutic Target Database（TTD）、DrugBank 5个数据库中收集。合并5个数据库并删除重复基因共获得2343个OA相关基因。使用jvenn在线工具绘制韦恩图，共得到67个交集基因（如图1B）。

2.2 PPI网络构建及核心基因分析

将PP2和OA的交集基因导入到STRING 11.5数据库中，把物种设置为人，置信度的最小交互阈值设定＞0.7，得到PPI网络图（如图2A）。然后将结果导入到Cytoscape软件中，用以构建PPI网络，再使用CytoNCA插件对网络中BC进行分析得到核心靶点。其中红色代表核心靶点，共得到15个最相关基因（如图2B）。

2.3 GO 和 KEGG富集分析

使用R/Bioconductor clusterProfiler软件，并按照P≤0.05，Q≤0.05为标准进行富集。GO富集结果显示，在BP上主要富集在肽基-酪氨酸磷酸化、肽基-酪氨酸修饰、激酶活性的正向调节等项目；在CC方面主要富集在膜筏、膜微域、焦点粘连等项目；在MF上主要富集在蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等项目（如图3A）。KEGG通路富集分析显示，主要富集在PI3K-Akt信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、卡波西肉瘤-相关的疱疹病毒感染、胰腺癌、表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂耐药性等通路上（如图3B）。

2.4 验证PP2与靶点的相互作用

通过分子对接模拟PIK3CA、MAPK8、EGFR和SRC四种靶点与PP2相互作用来验证PP2与靶点的结合。通常认为，结合能越低，结合亲和力越高。我们的结果显示，所选定的四种靶点与PP2的最小结合能都远低于-5.0 kJ/mol。与PIK3CA对接后的结合能为-8.9；与MAPK8对接后的结合能为-7.6；与EGFR对接后的结合能为-6.8；与SRC对接后的结合能为-6.5。图4为对接结果的可视化，分子对接结果表明，PP2与这四种核心靶点具有良好的结合力。

2.5 PP2能够促进软骨生成

为了确定PP2是否促进软骨生成，提取大鼠原代软骨细胞，加入不同浓度的（0，20 μM PP2共处理24小时后，提取细胞总RNA和蛋白进行相关实验。qRT-PCR结果显示，与对照组相比，PP2显著上调了软骨生成的主转录因子SOX9，也上调了COL2A1和Aggrecan，同时下调了ADAMTS5、MMP13和MMP9水平（如图5A）。Western blotting 结果也得到相同结论（如图5B）。

3 讨 论

PP2是一种SRC家族激酶广泛抑制剂，在抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激方面都有一定作用。PP2可抑制肺癌A549细胞、乳腺癌细胞和人舌鳞癌细胞Tca8113等癌细胞的侵袭和转移能力［16-17］。SRC激酶抑制剂PP2对人舌鳞癌Tca8113细胞侵袭和转移的抑制作用。PP2还可显著改善LPS诱导的肾功能丧失和包括炎症及氧化应激在内的损伤，同时还能降低促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-8等的表达。研究表明，PP2能够抑制EGFR、JAM-A Y280和酪氨酸等的磷酸化［18］。OA是一种最常见的关节疾病，能够严重影响患者生活质量。随着研究的深入，人们发现OA的不同发病阶段可能存在多种致病机制，包括TGF-β通路、NF-kB通路、β-catenin通路和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路等，但到目前为止还未找到一种有效的用于临床的治疗药物。

在本研究中，我们通过网络药理学分析发现，PP2和OA的交集基因有67种。PPI网络构建结果显示，mTOR、EGFR、SRC、MAPK8、PIK3CA、MAPK14、SDHA、EGF、CREBBP JAK1、CSNK2A2、ERBB2、PDGFRA、KIT和SOD2为最核心靶点。mTOR是细胞代谢的主要调节因子，它能控制细胞的生长、增殖和存活。mTOR包含两种不同的复合物：mTORC1和mTORC2［19］。研究发现滑膜中mTORC1的活化增强了巨噬细胞，并加重了胶原酶诱导的OA的症状［20］。EGFR是OA中最值得研究的信号通路之一。软骨中缺乏EGFR会导致关节软骨表面缺陷，明显加重OA發展［21］。MAPK是细胞病理学和生理学的重要调节因子，在软骨分化过程中起着至关重要的作用。研究发现，通过部分抑制p38/ERK MAPK和p65/NF-κB信号传导可起到缓解OA进展的作用［21］。以上说明这些核心基因在OA进展过程中都起着重要调节作用。

GO富集分析表明，PP2和OA的交集基因，在BP上能夠调节肽基-酪氨酸磷酸化、肽基-酪氨酸修饰、激酶活性的正向调节和MAPK级联反应的正向调控等项目。在CC方面能调节膜筏、膜微域、焦点粘连和细胞-底物连接等项目。在MF方面能够调节蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性和跨膜受体蛋白激酶活性等项目。KEGG通路富集分析表明，核心基因对PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、JAK-STAT信号通路和AGE-RAGE信号通路等起到调节作用。其中PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和EGFR信号通路值得我们重点关注。有研究发现，在细胞方面，低浓度（10 μM）下PP2对癌细胞增殖的影响不显著，超过20 μM浓度时癌细胞生长越来越受到抑制，这一发现与其他人类癌细胞系的报告一致［22］。所以我们在大鼠原代软骨细胞中加入PP2（20 μM）后，提取细胞总RNA和蛋白，通过qRT-PCR和Western blotting实验发现，PP2能够促进软骨细胞的生成，同时下调了降解细胞基质的蛋白，如ADAMTS5、MMP13和MMP9。

综上所述，网络药理学为PP2治疗OA提供新的方法。本研究结果也表明，PP2可通过调控多种靶基因，达到多途径、多种通路缓解OA进展。但本次研究还存在一定局限性，由于实验数据是从在线数据库中获取并进行分析，其数据的实时性存在局限性，导致预测结果不同。所以后期还会进行更多、更全面的实验进行验证。

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（收稿日期：2022-12-11 修回日期：2023-02-15）

（编辑：潘明志）

基金项目：国家自然科学基金（32160209，82160357）

作者简介：张浩，男，在读硕士研究生，研究方向：骨与关节退行性疾病研究。E-mail：251084491@qq.com

通信作者：刘佳。E-mail：634886252@qq.com