不同地域草莓拟盘多毛孢根腐病菌致病力差异及对苯醚甲环唑的敏感性

吴娥娇　郭文龙　王志伟　关玲　乔玉山　赵密珍

摘要： 近年來中国草莓主产区拟盘多毛孢根腐病大面积发生并呈危害加重趋势。为明确不同地域来源拟盘多毛孢根腐病菌的致病力差异及其对苯醚甲环唑的敏感性，采用离体叶片和菌丝生长速率法对收集到的不同地域的73株病原菌菌株进行致病力分析和苯醚甲环唑敏感性测定。结果表明，不同地域来源的菌株致病力差异极显著，且和采样地年平均温度呈显著正相关。不同病原菌菌株对苯醚甲环唑的敏感性呈单峰分布，EC₅₀范围为0.01～2.94 μg/ml，平均值为1.34 μg/ml。菌丝生长速率与AUDPC（病情发展曲线下面积）之间无相关性，不同苯醚甲环唑质量浓度下菌丝生长速率和产孢量之间的相关性存在差异。研究结果为苯醚甲环唑应用于草莓拟盘多毛孢根腐病的精准防控提供科学依据。

关键词： 草莓拟盘多毛孢根腐病菌；苯醚甲环唑；致病力；敏感性

中图分类号： S436.63 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2023）01-0044-09

Virulence difference and sensitivity analysis to difenoconazole of Neopestalotiopsis clavispora crown rot pathogens isolated from strawberry plants of different areas in China

WU E-jiao¹， GUO Wen-long^1，2， WANG Zhi-wei^1，2， GUAN Ling¹， QIAO Yu-shan¹， ZHAO Mi-zhen¹

（1.Institute of Pomology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement， Nanjing 210014， China;2.College of Horticulture and Plant Protection， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Abstract： Strawberry crown rot caused by Neopestalotiopsis spp. has occurred in many areas in China and led to an increasing economic loss in recent years. In order to clarify the virulence difference of Neopestalotiopsis crown rot pathogens from different geographical sources and their sensitivity to difenoconazole， the pathogenicity analysis and sensitivity to difenoconazole of 73 pathogenic strains collected from different regions were determined by in vitro leaf and mycelial growth rate method. The results showed that the virulence of strains from different geographical sources was significantly different， and significantly positively correlated with the annual mean temperature of the sampling sites. The sensitivity of different pathogenic strains to difenoconazole showed a single peak distribution. The EC₅₀values of the 73 N. clavispora isolates ranged from 0.01 μg/ml to 2.94 μg/ml， with an average of 1.34 μg/ml. There was no correlation between mycelial growth rate and area under disease progress curve （AUDPC）， and the correlation between mycelium growth rate and conidia production was different under different difenoconazole concentrations. The results provide a scientific basis for the application of difenoconazole in the precise prevention and control of strawberry Neopestalotiopsis crown rot.

Key words： Neopestalotiopsis clavispora from strawberry crown root;difenoconazole;virulence;sensitivity

据联合国粮农组织统计，中国2021年草莓栽培总面积达1.29×10⁵hm²，总产量达3.39×10⁶t，产值超过2.50×10¹⁰元，是世界最大的草莓生产和消费国（http：//faostat.fao.org/）。随着草莓生产的产业化和规模化发展，大面积栽培品种单一化、过度连作和高度设施化等，使草莓生产上呈现出次要病害猖獗、病原物致病型变异加快的特点^[1-2]。甜查理是中国栽培面积一度占居第二位的主栽品种^[3]。由拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis）引起的草莓拟盘多毛孢根腐病（Neopestalotiopsis crown rot）在甜查理及以其为亲本育成的品种上发生严重，且呈现逐年加重趋势，个别田块发病率高达90%以上，造成绝产、绝收，已成为当前制约草莓生产的一种毁灭性病害^[4]。

目前中国对草莓拟盘多毛孢根腐病的研究还处于起步阶段，多集中于致病菌的分离鉴定、防控药剂筛选等方面^[4-12]。对该病害的命名和主要致病菌的鉴定结果不一，多数学者认为草莓出现叶片发红枯死是由草莓根腐病菌引起。宁志怨等^[4]在2019年首次报道了引起安徽省草莓红叶病的主要致病菌是棒状拟盘多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）；刘艳茹等^[5]研究发现引起江苏省徐州市草莓红叶根腐病的致病菌为Neopestalotiopsis roase；赵景楠等^[6]认为引起草莓棒孢叶斑病的主要致病菌也是棒状拟盘多毛孢；赵宇等^[7]认为拟盘多毛孢是引起草莓出现红叶枯死病的优势致病菌。目前生产上主要使用化学药剂进行草莓拟盘多毛孢根腐病的防控。苯醚甲环唑是一种内吸性广谱杀菌剂，通过抑制真菌细胞膜上甾醇类化合物的合成而影响细胞的正常生物代谢，对多种真菌病害具有较好的防治效果^[13]，在草莓生产上大面积且长期使用。温浩等^[9]测定了9种杀菌剂对新拟盘多毛孢病菌（Pestalotiopsis clavispora）的室内毒力，发现苯醚甲环唑的平均EC₅₀为0.47 μg/ml。宁志怨等^[10]测定草莓红叶病病原菌（Pestalotiopsis clavispora）对9种常用杀菌剂的敏感性时发现苯醚甲环唑在苗期和大田生长期的防效分别达90.16%和61.89%。刘艳茹^[11]的研究结果表明苯醚甲环唑对草莓拟盘多毛孢根腐病菌（Neopestalotiopsis roase）的最高抑制率达93.60%，对盆栽苗的最佳防效为96.67%，平均EC₅₀为0.06～0.84 μg/ml。李忠峰等^[12]研究结果表明10.00%的苯醚甲环唑对草莓红斑叶枯病病原菌（Pestalotiopsis clavispora）的EC₅₀为11.88 μg/ml，抑制率高达94.91%。

目前，关于草莓拟盘多毛孢根腐病菌致病力的研究报道很少，尤其是针对不同地域来源草莓拟盘多毛孢根腐病菌致病力差异与其對苯醚甲环唑敏感性的关联分析基本空白。本研究对2020年3-5月从中国25个地区分离到的288株病原菌中挑选73株代表性草莓拟盘多毛孢根腐病菌进行致病力分析及其对苯醚甲环唑的敏感性测定，以期明确不同地域来源病原菌的致病力差异，并探究其对苯醚甲环唑的敏感性，为杀菌剂的高效应用和草莓拟盘多毛孢根腐病的精准防控提供科学依据和指导。

1 材料与方法

1.1 样本采集

于2020年3-5月在草莓拟盘多毛孢根腐病发生盛期从中国15个省、直辖市和自治区的25个草莓种植区（表1）采集草莓植株定植后未使用过苯醚甲环唑及其相同作用机制杀菌剂且具有典型症状的设施栽培草莓发病植株（图1），草莓品种主要有甜查理、宁玉和宁丰等。

1.2 供试菌株

采用组织分离法^[14]进行草莓拟盘多毛孢根腐病菌的分离，挑取单孢进行病原菌纯化（图1），结合形态学和分子生物学进行病原菌鉴定，最终获得病原菌288株（表1）。依据地域来源、寄主品种和病原菌鉴定结果选取73株草莓拟盘多毛孢根腐病菌菌株（表2）用于后续研究。

1.3 供试药剂

96.00%苯醚甲环唑（Difenoconazole），购于上海安谱实验科技股份有限公司，用丙酮配制成1.0×10⁵μg/ml母液，于4 ℃冰箱保存，备用。99.50%丙酮，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.4 供试培养基

PDA培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉18 g，加入1 000 ml超纯水中，沸水煮20 min用四层纱布过滤后补充超纯水至1 000 ml，121 ℃灭菌20 min后备用。

含杀菌剂的PDA培养基：用丙酮将苯醚甲环唑母液依次稀释成0.50×10³μg/ml、1.50×10³μg/ml和3.00×10³μg/ml，分别吸取上述各质量浓度溶液400 μl加入至399.6 ml已灭菌且冷却至50 ℃左右的PDA培养基中，制成终质量浓度为0.50 μg/ml、1.50 μg/ml和3.00 μg/ml的含杀菌剂的PDA平板。

1.0%水琼脂培养基（WA）：琼脂粉10 g，加水定容至1 000 ml，加热至琼脂完全溶化后分装，121 ℃灭菌20 min，备用。

1.5 草莓拟盘多毛孢根腐病菌致病力分析

依据同质园试验（Common garden experiment）原理^[15]在离体感病品种宁玉上进行拟盘多毛孢根腐病菌致病力分析。具体方法：无菌条件下将从健康植株上采集的大小、叶龄一致的新鲜叶片置于预先备好的1.0%水琼脂培养基的培养皿（直径10 cm）中，每皿放两片叶，叶背朝上，用昆虫针在每张叶片背部相同位置刺一直径约0.50 mm的针孔。随后用无菌枪头从PDA培养基上活化培养7 d的菌落边缘取直径为5 mm的菌饼，倒置接种于针孔处。每处理接种3皿，共6片叶，以接种直径为5 mm的无菌PDA为对照。于恒温26.0 ℃、湿度95.00%、光照16 h/黑暗8 h的培养箱中培养48 h后将叶片翻为正面，于接种后2～5 d内每间隔24 h用数码相机固定焦距获取病斑图像。采用ImageJ1.51软件进行病斑面积的获取，对第5 d病斑面积和2～5 d病情发展曲线下面积（AUDPC）^[16]进行分析，AUDPC参照公式（1）计算。

式（1）中t_i表示第i次获取照片的时间（d），x_i表示第i次测定时叶片的病斑面积，n表示病斑面积测定总次数（n=4）。

1.6 草莓拟盘多毛孢根腐病菌对苯醚甲环唑的敏感性测定

采用菌丝生长速率法^[17]进行草莓拟盘多毛孢根腐病菌对苯醚甲环唑的敏感性测定。将表2选定的草莓拟盘多毛孢根腐病菌接种在PDA平板上预先活化培养7 d后，在菌落边缘取直径为5 mm的菌饼，分别将菌丝面朝下接种至含0.50 μg/ml、1.50 μg/ml和3.00 μg/ml苯醚甲环唑的PDA平板中心，以含等量丙酮的PDA平板为对照（CK），每处理重复3次，于26 ℃恒温培养箱内黑暗培养，自接菌后的第2～5 d每间隔24 h用数码相机固定焦距后拍照，用ImageJ 1.51软件进行菌落直径和菌落面积的获取。以拍摄时间为x，当天菌落面积的自然对数为Y，用SLOPE函数计算得到病原菌的菌丝生长速率^[18]。菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%，以菌丝生长抑制率为纵坐标（Y），药剂质量浓度的常用对数值为横坐标（x），求出毒力回归方程和相关系数（r），计算各处理的抑制中浓度（EC₅₀）。使用R语言vioplot工具进行菌丝生长速率概率分布分析，利用Pearson相关法^[19]分析菌丝生长速率和致病力间的相关性。

1.7 草莓拟盘多毛孢根腐病菌产孢量测定

试验设计同方法1.6。在草莓拟盘多毛孢根腐病菌对苯醚甲环唑敏感性试验中，接种培养第10 d从6个地域来源的菌株中各选取1株，共6株，进行产孢量测定。具体测定方法为：用打孔器从培养基中心接菌处向外依次呈十字辐射状取一定数量直径为5 mm的菌饼，置于加有5 ml无菌水的离心管中，并加入5～8粒灭菌的玻璃珠，于转速为200 r/min的恒温26 ℃摇床中震荡20 min，以促进孢子释放。随后用无菌牙签将病原菌饼取出，于4 000 r/min低速离心机中离心12 min，弃上清液后加入200 μl无菌水，于10×10倍显微镜下采用血球计数板计算每1 cm²孢子数，每菌株重復测定3次。

2 结果与分析

2.1 草莓拟盘多毛孢根腐病菌的致病力

病斑面积是病原菌致病力的重要特征。草莓离体叶片在接种73株拟盘多毛孢根腐病菌后2～5 d病斑面积呈不断扩大的趋势（图2）。不同地域来源的菌株接种后第5 d平均病斑面积和2～5 d AUDPC分别为1.65～5.91 cm²和3.08～13.48。来自凉山的17株菌株致病力较强，第5 d平均病斑面积和AUDPC分别为5.91 cm²和15.79，云南昆明的6株菌株致病力最弱，第5 d平均病斑面积和AUDPC分别为1.65 cm²和3.08。不同地域来源的菌株，甚至来源同一地域的菌株接种后第5 d病斑面积和AUDPC存在显著差异，说明不同地域来源甚至来源同一地域的病原菌存在较大的致病力差异（表3）。随着菌株来源地年平均温度的增加，菌株的AUDPC呈增大趋势，即AUDPC与菌株来源地的年平均温度呈显著正相关（图3）。

2.2 苯醚甲环唑对草莓拟盘多毛孢根腐病菌菌丝生长的影响

图4为不同苯醚甲环唑质量浓度对呼和浩特草莓拟盘多毛孢根腐病菌菌株HHHT-2接种5 d后菌丝生长的影响。从图4中可以看出，随苯醚甲环唑质量浓度的增加，草莓拟盘多毛孢根腐病菌生长受到的抑制作用增强。不同苯醚甲环唑质量浓度下，供试的73株病原菌菌丝生长速率概率分布如图5所示。73株病原菌最高概率密度所对应的菌丝生长速率及菌丝生长速率均值（期望值）随苯醚甲环唑质量浓度的增加逐渐降低。不同地域来源的病原菌菌丝生长速率存在一定的差异（表4）。在CK以及0.50 μg/ml、1.50 μg/ml、3.00 μg/ml苯醚甲环唑质量浓度下，病原菌的平均菌丝生长速率分别为0.96、0.80、0.74和0.70。整体来看，来自年平均温度较低地区（呼和浩特和临沂）的病原菌生长速率较快，而来自年平均温度较高地区（福州和凉山）的病原菌生长速率较慢。在CK以及0.50 μg/ml、1.50 μg/ml、3.00 μg/ml苯醚甲环唑质量浓度下，病原菌菌丝生长速率与采样地的年平均温度的相关系数分别为-0.58、-0.53、-0.79和-0.92。随苯醚甲环唑质量浓度的增加病原菌菌丝生长速率和年平均温度的负相关性越强，在3.00 μg/ml时呈极显著负相关。说明在化学药剂的胁迫下，病原菌的菌丝生长速率受本地年平均温度的影响愈严重。

2.3 草莓拟盘多毛孢根腐病菌对苯醚甲环唑的敏感性

EC₅₀是体现病原菌对杀菌剂敏感程度的重要指标。苯醚甲环唑对73株草莓拟盘多毛孢根腐病菌的EC₅₀为0.01～2.94 μg/ml，平均值为1.34 μg/ml。在草莓拟盘多毛孢根腐病菌对苯醚甲环唑的敏感性测定范围内，将EC₅₀分为6个区间，统计每个区间内的菌株个数及频率，可以看出73株草莓拟盘多毛孢根腐病菌对苯醚甲环唑的敏感性频率分布呈单峰变化（图6）。EC₅₀为0.51～1.00 μg/ml区间内菌株分布最多，其频率值为24.46%。9株采集自盐城地区的菌株呈现较高的EC₅₀（1.63 μg/ml），来自临沂的18株菌株呈现较低的EC₅₀（1.21 μg/ml）（表5），说明临沂地区的草莓拟盘多毛孢根腐病菌比盐城地区的对苯醚甲环唑更敏感，可见不同地域来源的病原菌株对苯醚甲环唑的敏感性不同。

2.5 草莓拟盘多毛孢根腐病菌菌丝生长速率与产孢量的相关性

对不同地域来源的6株草莓拟盘多毛孢根腐病菌产孢量的分析结果表明，不同地域来源的菌株在不同苯醚甲环唑质量浓度下其產孢量存在一定差异，随苯醚甲环唑质量浓度增加病原菌产孢量下降，在CK以及0.50 μg/ml、1.50 μg/ml、3.00 μg/ml苯醚甲环唑质量浓度下6个病原菌平均产孢量分别为1 cm²6.17个、4.00个、3.61个、2.93个。产孢量与菌丝生长速率的相关性分别为-0.39，-0.82，-0.92，-0.74。在0.50 μg/ml和1.50 μg/ml苯醚甲环唑质量浓度下菌丝生长速率与产孢量均呈显著负相关（图8）。

3 讨论

在植物病害的防控过程中，探究植物病原菌与寄主的进化演化规律是病害防控的关键，病原菌的致病力除和自身的生物学特性相关外，同时也受寄主植物与外界环境的共同影响^[18，20]。在全球气候变化的大背景下，病原菌为更好地生存和繁衍会通过迁移或改变自身的适应能力来应对环境的变化。有关病原菌致病力的评价指标多采用潜伏期、发病率或病斑面积等，本研究基于不同时间病斑面积及AUDPC进行评价。研究发现不论是病斑面积还是AUDPC对不同地区间菌株的致病力评价结果一致，不同地域来源的菌株以及同一地区的菌株个体间致病力存在较大差异，且不同地域菌株间的致病力和样本来源地的年平均温度呈显著正相关（图3），来自年平均温度较高地区如福州和凉山的菌株呈现较高的致病力，反之则低。这说明草莓拟盘多毛孢根腐病菌对温度可能存在本地适应性，这与前人在拟盘多毛孢乃至其他病原真菌和卵菌上的研究结果一致^[18，21]。

病原菌的抗药性是指对杀菌剂敏感的植物病原菌个体或群体长期受到农药的作用引起的^［22-23］，由于靶标基因的位点突变以及靶标基因和运输体基因的过量表达等遗传变异呈现出对药剂敏感性下降的现象^[24]。草莓生产上除用苯醚甲环唑防治拟盘多毛孢根腐病外，还用来防控炭疽根腐病（Colletotrichum crown rot）和疫霉根腐病（Phytophthora crown rot）等一些常见的病原真菌或卵菌病害。由于频繁连续使用苯醚甲环唑，导致生产上用药量逐年上升，已有较多病原菌对苯醚甲环唑产生抗药性的报道^[25-28]。本研究发现不同苯醚甲环唑质量浓度下，不同地域来源的草莓拟盘多毛孢根腐病菌菌丝生长速率存在一定差异，来自年平均温度较低地区（呼和浩特和临沂）的病原菌生长相对较快，敏感性较差，预示着这些采样地的草莓拟盘多毛孢群体中可能存在对该药剂敏感性低的天然耐药菌株。本研究所选菌株样本均为生长期未施用过苯醚甲环唑及其相同作用机制药剂的菌株，整体来看，73株草莓拟盘多毛孢根腐病菌对苯醚甲环唑的敏感性特征（EC₅₀）呈单峰曲线，平均EC₅₀为1.34 μg/ml，同前人^{[8，11，29]}的研究结果相比敏感性有所降低。因此，在未来使用苯醚甲环唑甚至相同作用机制药剂时应格外重视其抗药性的监测。菌丝生长速率的差异表明草莓拟盘多毛孢根腐病菌可能在侵染寄主时存在致病力的差异，在对其进行致病力测定时发现73株病原菌在致病力上存在显著差异，而致病力差异与菌丝生长速率差异类似，在不同菌株间存在特异性。不同苯醚甲环唑质量浓度下草莓拟盘多毛孢根腐病菌菌丝生长速率和致病力之间不存在相关性，这说明在实际侵染寄主植物时菌丝生长速率并不能与致病力及发病程度直接相关。6株不同地域来源的菌株产孢量也存在较大差异，已有研究结果证明真菌的致病毒素在其致病过程中发挥关键作用，毒素多由孢子萌发产生，一般来讲产孢量多意味着其毒素产生量多，对寄主植物的致病力越强^[30]。本研究发现，不同苯醚甲环唑质量浓度下草莓拟盘多毛孢根腐病菌的菌丝生长速率与产孢量的相关性存在差异，且菌丝生长速率和AUDPC不存在相关性。这可能因为致病力除与毒素产量相关外，还与细胞壁降解酶、主要致病因子多聚半乳糖醛酸酶等多种因素有关造成的^[31]。因此，不同病原菌菌株致病力差异机理尚需进行更深入全面的研究。

总之，考虑到作用机制和降低抗药性风险，建议生产中应尽量避免苯醚甲环唑等DMI（14α-脱甲基酶抑制剂）类药剂的单一使用，尽量将其与其他内吸性或者保护性杀菌剂混合或者交替使用，最大限度延长苯醚甲环唑的使用寿命。此外，各地的病原菌在致病力、菌丝生长速率等方面存在一定的差异，因此，还应根据当地的气候环境制定草莓拟盘多毛孢根腐病的区域防控策略，从而实现对病害的可持续有效防控。

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（责任编辑：石春林）