甘草酸凝胶的流变学性质及其对橙皮苷的增溶作用研究

杨凯丽，郭子硕，张 翼，陈宛灵，王晓静，杜守颖，李鹏跃

北京中医药大学中药学院，北京 102442

甘草为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、光果甘草G.glabraL.或胀果甘草G.inflataBat.的干燥根及根茎，其味甘、性平，具有补脾益气、祛痰止咳、缓急止痛等功效。甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）属三萜皂苷类化合物，是甘草中含量最高的有效成分，具有抗肿瘤[1-2]、抗炎[3]、抗病毒[4]等药理作用。甘草酸由1 分子甘草次酸和2 分子葡萄糖酸组成，其两亲性结构使甘草酸具有自组装性，能够形成具有疏水性内腔的纳米纤维[5]或凝胶，从而提高疏水性药物的溶解度[6]，同时，凭借其抗菌性强、临界凝胶浓度低、可实现可逆性凝胶-溶胶转变等优异性能，甘草酸已成为一种具有巨大应用价值的药物递送系统而被广泛研究[7]。

半固体制剂的流变学性质一定程度上能够反映制剂的微观结构，对药物从制剂中的释放具有重要影响，但目前甘草酸凝胶的流变学特性尚缺乏深入研究。橙皮苷是芸香科植物中含有的一种黄酮类化合物，具有抗肿瘤[8]、抗炎[9]、调节免疫[10]、抗心血管疾病[11]等药理作用，但由于其溶解度低，极大地限制了其在医学、食品领域中的应用。因此，本研究拟探究甘草酸质量浓度、溶剂pH 值、Na+质量浓度、Ca2+质量浓度对甘草酸凝胶流变学性质的影响，同时评价其对疏水性药物橙皮苷的溶解度和体外释药行为的影响，为甘草酸凝胶的实际应用提供部分参考依据。

1 仪器与试药

1.1仪器

BSA 224S 型电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HH-G1 型数显恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司；Anton Paar MCR 302 型旋转流变仪，奥地利安东帕有限公司；Ultimate U3000型高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；Waters X Bridge·Shield RP18C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 试药

对照品甘草酸（批号A25GS146530，质量分数≥95%）、橙皮苷（批号N22GS168518，质量分数≥95%），上海源叶生物科技有限公司；娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；氢氧化钠、盐酸、氯化钙、氯化钠，分析纯，北京化学试剂公司；乙腈、磷酸，色谱级，美国赛默飞世尔科技有限公司；pH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）片剂，北京索莱宝科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 甘草酸凝胶样品的制备

2.1.1 不同质量浓度甘草酸凝胶的制备 分别精密称取甘草酸50、100、200、300、400、500、600 mg于10 mL 水中，在60 ℃水浴下缓慢搅拌，使甘草酸充分溶解，形成透明均一的甘草酸水溶液，室温静置12 h 使其凝固，即得不同质量浓度甘草酸凝胶。

2.1.2 不同pH 值甘草酸凝胶的制备 以氢氧化钠溶液和稀盐酸调节纯净水pH 值分别至3、7、11，精密称取甘草酸300 mg 于10 mL 不同pH 值的水中，在60 ℃水浴下缓慢搅拌，使甘草酸充分溶解，形成透明均一的甘草酸水溶液，室温静置12 h 使其凝固，即得不同pH 值甘草酸凝胶。

2.1.3 含不同质量浓度Na+的甘草酸凝胶的制备分别配制质量浓度为0.5、1.0、5.0、8.6 mg/mL 的NaCl 溶液作为溶剂，精密称取甘草酸300 mg 于10 mL 不同质量浓度的NaCl 溶液中，在60 ℃水浴下缓慢搅拌，使甘草酸充分溶解，形成透明均一的甘草酸水溶液，室温静置12 h 使其凝固，即得含不同质量浓度Na+的甘草酸凝胶。

2.1.4 含不同质量浓度Ca2+的甘草酸凝胶的制备分别配制质量浓度为0.1、0.2 mg/mL 的CaCl2溶液作为溶剂，精密称取甘草酸300 mg 于10 mL 不同质量浓度的CaCl2溶液中，在60 ℃水浴下缓慢搅拌，使甘草酸充分溶解，形成透明均一的甘草酸水溶液，室温静置12 h 使其凝固，即得含不同质量浓度Ca2+的甘草酸凝胶。

2.2 甘草酸凝胶的流变学性能测试

2.2.1 应变扫描实验 选择25 mm 平板转子，于旋转流变仪上对各样品进行应变扫描，测试温度25 ℃，测试间距1 mm，角频率10 rad/s，应变由0.01%扫描至100%，绘制各凝胶的储能模量（G′）、损耗模量（G″）随剪切应变的变化曲线，由G″与G′的比值求得各凝胶的损耗系数。

2.2.2 稳态流变实验 选择25 mm 锥板转子，锥角为2°，于旋转流变仪上对各样品进行稳态扫描，测试温度25 ℃，测试间距1 mm，应变为0.01%，剪切速率由0.01 s-1扫描至100 s-1，绘制各凝胶的流变曲线即黏度随剪切速率的变化曲线，对流变曲线进行拟合得零剪切黏度（η0）、无穷剪切黏度（η∞）、特征松弛时间（c）、剪切稀化指数（n）、剪切应力（γ）。

2.2.3 不同质量浓度的甘草酸凝胶的流变学性质按“2.2.2”项下方法对不同质量浓度的甘草酸凝胶进行稳态流变实验，分别得到各凝胶的黏度-剪切速率曲线及γ-剪切速率曲线。利用Power Law、Herschel-Bulkley、Casson、Carreau/Yasuda、Cross 5种常用的流变学模型对各甘草酸凝胶的流变曲线进行拟合，根据各模型对不同质量浓度甘草酸凝胶流变参数拟合的流变曲线决定系数（R）的平均值，选择最佳的流变学模型对凝胶性质进行分析[12]，各模型拟合结果如表1 所示，Cross 模型拟合的R值最大，拟合效果最佳，因此，选择Cross 模型对甘草酸凝胶的流变学行为进行分析。

表1 常用流变学模型及拟合情况Table 1 Common rheological models and fitting

η0是指物料在接近于零的剪切速率下表现为黏性流体特征时所具有的恒定不变的黏度，反映物料在未受到剪切作用时的黏度；η∞是指剪切速率趋于无穷大时物料的黏度。c是指凝胶受外力作用发生形变时，去除外力后恢复到原有结构所需的时间。η0和c均与流体微观结构和分子间作用力有关，能够反映凝胶网络结构中分子链间活性联结点的密度和支链长度[13]。n能够表征流体剪切稀化的程度，其值越大，流体剪切稀化的程度越小[14]。对不同质量浓度甘草酸凝胶的流动曲线进行Cross 模型拟合，拟合结果如表2 所示，当甘草酸质量浓度在5～60 mg/mL 时，甘草酸凝胶的η0和c随甘草酸质量浓度的提高而增大，表明甘草酸纳米纤维延伸长度可能随着甘草酸质量浓度增加而延长，纳米纤维活性联结点数量更加密集，缠结程度提高，对甘草酸凝胶各层间发生相对位移具有阻碍作用。随着甘草酸质量浓度增大，甘草酸凝胶的η∞和n逐渐增大，剪切稀化能力减弱。

表2 不同质量浓度甘草酸凝胶的稳态流动特性Table 2 Steady flow characteristics of glycyrrhizic acid gel with different concentrations

在锥板旋转剪切过程中，50、60 mg/mL 的甘草酸凝胶出现一定程度的失水现象，发生相分离。不同质量浓度甘草酸凝胶的γ、黏度随剪切速率变化的曲线如图1 所示，甘草酸质量浓度为5～40 mg/mL时，各质量浓度甘草酸凝胶的γ均随剪切速率的不断增大而增大；当甘草酸质量浓度为50～60 mg/mL时，随着剪切速率的增大，同一甘草酸凝胶的γ先增大后减小，推测其γ的减小与该质量浓度凝胶实验过程中的相分离现象有关，可能是由于剪切速率大于某一临界值后，甘草酸凝胶结构突然破坏导致的[15]。在测试的剪切速率范围内，不同质量浓度甘草酸凝胶的黏度均随剪切速率的增大而减小，即发生剪切稀化；任一剪切速率下，甘草酸凝胶的黏度随甘草酸质量浓度的增大而增大。

图1 不同质量浓度甘草酸凝胶的黏度 (A) 和γ (B) 随剪切速率变化曲线Fig. 1 Curves of viscosity (A) and γ (B) of glycyrrhizic acid gel with different concentrations versus shear rate

按“2.2.1”项下方法对不同质量浓度的甘草酸凝胶进行应变扫描实验，得到不同质量浓度甘草酸凝胶的G′、G″，结果如图2-A 所示。在凝胶的应变扫描曲线中，曲线上平台区对应的模量值为平台模量，其大小与凝胶微观结构中纳米纤维间的缠结密度呈正比[16]。

图2 不同质量浓度甘草酸凝胶G′或G″ (A) 和损耗系数 (B)随应变变化曲线Fig. 2 Curves of G′ or G″ (A) and loss coefficient (B) of glycyrrhizic acid gel with different concentrations changing with strain

损耗系数是流体的G″与G′的比值，当损耗系数小于1 时，主要表现出弹性行为，当损耗系数大于1 时，流体主要表现出黏性行为[17]。由应变扫描结果可知，当甘草酸质量浓度不断增大时，甘草酸凝胶的G′与G″均不断增大，表明随质量浓度增大甘草酸凝胶的黏弹性变强，甘草酸凝胶微观结构中纳米纤维间的物理联结点密度增大，这与不同质量浓度甘草酸η0所反映的变化趋势相一致。

不同质量浓度甘草酸凝胶的损耗系数随应变值的变化曲线如图2-B 所示，甘草酸质量浓度在20～60 mg/mL 时，随着甘草酸质量浓度的增大，甘草酸凝胶损耗系数等于1 的应变值，即甘草酸凝胶转变为甘草酸溶胶的应变值总体呈减小趋势，凝胶的弹性性质逐渐减弱。甘草酸质量浓度在5～10 mg/mL时，可能由于凝胶剪切稀化作用强烈，受剪切后凝胶稀化为近溶液状态，因此，在同一测试条件下测得的损耗系数波动较大，导致其与较高质量浓度甘草酸凝胶变化规律相反。

2.2.4 不同pH 值对甘草酸凝胶流变学性质的影响按“2.2.2”项下方法对不同pH 值溶剂制备得到的甘草酸凝胶进行稳态流变实验和Cross 模型拟合，结果如表3 所示。随着pH 值的增大，甘草酸凝胶的η0和c不断减小，提示甘草酸凝胶体系中纳米纤维间的联结点密度及支链长度随pH值增大而减小，这可能是由于甘草酸分子中存在大量羧基，其pKa值分别为pKa1＝3.98、pKa2＝4.62、pKa3＝5.17[18]，当分散介质pH 值小于羧基的pKa时，发生解离的羧基数目少；随着分散介质pH 值增大，发生解离的羧基数目大大增加，有效电荷密度提高，导致甘草酸分子间氢键减弱，静电斥力增强，从而导致凝胶的η0降低，c缩短。而随着分散介质pH 值的增大，甘草酸凝胶的η∞和n也不断减小，表明其剪切稀化特征逐渐增强。

表3 不同pH 值溶剂制得的甘草酸凝胶的稳态流动特性Table 3 Steady flow characteristics of glycyrrhizic acid gel prepared with different pH solvents

不同pH 值溶剂制得的甘草酸凝胶的γ、黏度随剪切速率变化的曲线如图3 所示，随着剪切速率的不断增大，不同pH 值溶剂制得的甘草酸凝胶的γ均不断增大。而在相同剪切速率下，溶剂pH 值为7时，制备得到的甘草酸凝胶γ最大，pH 值为3 或11时甘草酸凝胶的γ减小。不同pH 值甘草酸凝胶的黏度均随着剪切速率的增大而减小。当剪切速率小于0.13 s-1时，甘草酸凝胶的黏度大小为pH 3＞pH 11＞pH 7；当剪切速率大于0.13 s-1且小于5.4 s-1时，甘草酸凝胶的黏度大小为pH 3＞pH 7＞pH 11；当剪切速率大于5.4 s-1时，甘草酸凝胶的黏度大小为pH 7＞pH 3＞pH 11，总体来看pH 值对甘草酸凝胶的黏度影响较小。

图3 不同pH 值溶剂制得的甘草酸凝胶的γ (A)、黏度 (B)随剪切速率变化曲线Fig. 3 Curves of γ (A) and viscosity (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with different pH solvents versus shear rate

按“2.2.1”项下方法对不同pH 值溶剂制得的甘草酸凝胶进行应变扫描实验，结果如图4-A 所示，随着pH 值的增大，甘草酸凝胶的初始平台模量先增大后减小，提示在凝胶的微观结构中，纳米纤维间的物理联结点密度随体系pH 值的增大先增大后减小。不同pH 值溶剂制得的甘草酸凝胶的损耗系数随应变值的变化曲线如图4-B 所示，损耗系数随着pH 值的增大表现出先增大后减小的趋势，不同pH 值溶剂配制的甘草酸凝胶转变为甘草酸溶胶的应变值先减小后增大，表明随着pH 值的增大甘草酸凝胶的弹性性质先减小后增大。

图4 不同pH 值溶剂制得的甘草酸凝胶G′或G″ (A) 和损耗系数 (B) 随应变变化曲线Fig. 4 Curves of G′ or G″ (A) and loss coefficient (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with different pH solvents versus strain

2.2.5 不同NaCl 质量浓度对甘草酸凝胶力学性质的影响 按“2.2.2”项下方法对不同质量浓度NaCl溶液配制的甘草酸凝胶进行稳态流变实验和Cross模型拟合，结果如表4 所示。随着体系中Na+质量浓度的提高，甘草酸凝胶的η0和c不断增大，这可能是由于Na+的静电屏蔽效应随其质量浓度的提高而增强，且Na+的存在抑制了甘草酸的电离，使得甘草酸分子间的静电力斥力减小[19]，分子间作用力增强，η0增大。η∞和n也随Na+质量浓度的提高而增大，甘草酸凝胶的剪切稀化能力减弱。

表4 不同质量浓度NaCl 溶液制得的甘草酸凝胶的稳态流动特性Table 4 Steady flow characteristics of glycyrrhizic acid gel prepared with NaCl solution of different concentrations

在锥板旋转剪切过程中，体系中NaCl 质量浓度等于或高于5.0 mg/mL 的甘草酸凝胶出现一定程度的失水现象，发生相分离。不同质量浓度NaCl 溶液制得的甘草酸凝胶γ、黏度随剪切速率变化曲线如图5 所示，随着体系中Na+质量浓度的提高，甘草酸凝胶获得相同剪切速率所需的γ明显增大。当体系中NaCl 质量浓度等于或高于5.0 mg/mL 时，同一甘草酸凝胶的γ随剪切速率的增大首先发生骤降然后逐渐升高，表明此时甘草酸凝胶在γ作用下，具有明显的脆性特征[20]，的增大首先发生骤降然后逐渐升高，表明此时甘草这与该凝胶在锥板旋转剪切过程中失水发生相分离的现象相应，说明当体系中NaCl 质量浓度等于或高于5.0 mg/mL 以上时，甘草酸凝胶的网络结构易被破坏，结构发生破坏后的甘草酸凝胶仍具有剪切稀化特征。

图5 不同质量浓度NaCl 溶液制得的甘草酸凝胶的γ (A)、黏度 (B) 随剪切速率变化曲线Fig. 5 Curves of γ (A) and viscosity (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with different concentrations of NaCl solution versus shear rate

按“2.2.1”项下方法对不同质量浓度NaCl 溶液制得的甘草酸凝胶进行应变扫描实验，结果如图6-A 所示，随着Na+质量浓度的提高，甘草酸凝胶的初始平台模量显著增大，说明在Na+存在下，甘草酸凝胶中纳米纤维间活性联结点数量明显增加，但当剪切应变增大到某一临界值时，G′与G″均骤减至10 kPa 以下，黏弹性突然降低，与稳态流动实验中甘草酸凝胶γ骤减的现象相符合。但溶剂中Na+质量浓度对甘草酸凝胶骤降后的平台模量无显著影响，说明NaCl 的加入虽提高了甘草酸凝胶中活性联结点的数量，但活性联结点数量的增加对甘草酸凝胶在外力作用下的抗形变能力和发生形变后的黏弹性没有明显影响，而使凝胶的脆性增大，趋近于固体性质。不同质量浓度NaCl 溶液制得的甘草酸凝胶的损耗系数随应变值的变化曲线如图6-B 所示，由于体系中NaCl 的存在，甘草酸凝胶转变为溶胶的应变值有所减小，即凝胶弹性减弱。且随着Na+质量浓度的提高，甘草酸凝胶转变为溶胶的应变值先减小后增大，表明甘草酸凝胶的弹性性质在0.5～5.0 mg/mL 逐渐减弱，在5.0～8.6 mg/mL 逐渐增强，且在凝胶制备过程中发现，当溶液中NaCl 质量浓度等于或高于5.0 mg/mL 时，甘草酸凝胶不再澄清，宏观抗形变能力明显增强。

图6 不同质量浓度NaCl 溶液制得的甘草酸凝胶G′或G″(A) 和损耗系数 (B) 随应变变化曲线Fig. 6 Curves of G′ or G″ (A) and loss coefficient (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with NaCl solution of different concentrations versus strain

2.2.6 不同CaCl2质量浓度对甘草酸凝胶力学性质的影响 按“2.2.2”项下方法对不同质量浓度CaCl2水溶液配制的甘草酸凝胶进行稳态流变实验和Cross 模型拟合，结果如表5 所示，溶剂中加入CaCl2后甘草酸凝胶的η0显著增大，但随着CaCl2质量浓度的提高，甘草酸凝胶η0逐渐降低，这可能是由于Ca2+质量浓度的提高，在其所产生的静电屏蔽效应和配位键共同作用下，甘草酸纳米纤维内部分子缔合作用增强，导致甘草酸纳米纤维的延伸受到抑制并发生卷曲闭合[21]。随着Ca2+质量浓度的提高，甘草酸凝胶的c缩短，n增大，剪切稀化能力减小。同时，随着Ca2+质量浓度的提高，η∞增大，表明η∞与η0的变化趋势不一定相同。

表5 不同质量浓度CaCl2 溶液制得的甘草酸凝胶的稳态流动特性Table 5 Steady flow characteristics of glycyrrhizic acid gel prepared with CaCl2 solution of different concentrations

不同质量浓度CaCl2溶液制得的甘草酸凝胶的γ、黏度随剪切速率变化曲线如图7 所示，随着体系中Ca2+质量浓度的提高，甘草酸凝胶获得相同剪切速率所需的γ增大，凝胶的黏度随Ca2+质量浓度的提高而增大。

图7 不同质量浓度CaCl2 溶液制得的甘草酸凝胶的γ (A)、黏度 (B) 随剪切速率变化曲线Fig. 7 Curves of γ (A) and viscosity (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with different concentrations of CaCl2 solution versus shear rate

按“2.2.1”项下方法对不同质量浓度CaCl2溶液制得的甘草酸凝胶进行应变扫描实验，结果如图8-A 所示，随着CaCl2质量浓度的提高，甘草酸凝胶的初始平台模量增大，可能是由于Ca2+促进甘草酸凝胶中网络结构的构建，能够增加甘草酸纳米纤维间活性联结点的数量。不同质量浓度CaCl2溶液制得的甘草酸凝胶的损耗系数随应变值的变化曲线如图8-B 所示，体系中Ca2+的存在使得甘草酸凝胶向溶胶转变的应变值显著减小，凝胶的弹性明显降低，且随着Ca2+质量浓度的增大，体系由凝胶转变为溶胶的应变值减小，表明甘草酸凝胶的弹性性质在0.1～0.2 mg/mL 减弱。

图8 不同质量浓度CaCl2 溶液制得的甘草酸凝胶G′或G″(A) 和损耗系数 (B) 随应变变化曲线Fig. 8 Curves of G′ or G″ (A) and loss coefficient (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with different concentrations of CaCl2 solution versus strain

2.3 HPLC 法测定甘草酸含量

2.3.1 甘草酸对照品溶液的制备 精密称取甘草酸对照品适量，加70%乙醇制得质量浓度为150.80 μg/mL 的甘草酸对照品母液，取不同体积甘草酸对照品母液加70%乙醇稀释得质量浓度分别为75.40、37.70、18.85、9.42、4.71、2.36 μg/mL 的甘草酸对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备

（1）甘草酸凝胶供试品溶液：取甘草酸凝胶于60 ℃下搅拌溶解得甘草酸溶胶，取甘草酸溶胶0.2 mL 于50 mL 量瓶中，滴加甲醇至刻度线并混匀，即得。

（2）甘草酸凝胶释放供试品溶液：取甘草酸凝胶释放介质1 mL，即得。

2.3.3 色谱条件 色谱柱为Waters XBridge Shield RP18C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～8 min，19%乙腈；8～35 min，19%～50%乙腈；35～36 min，50%～100%乙腈；36～40 min，100%～19%乙腈；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长237 nm；理论塔板数均大于370 000。

2.3.4 专属性考察 取甘草酸凝胶、甘草酸凝胶释放样品按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，与“2.3.1”项下甘草酸对照品母液、70%乙醇溶液、甲醇、PBS 缓冲液分别按“2.3.3”项下色谱条件进样分析，考察该方法的专属性，结果如图9 所示。结果表明，各样品溶液的出峰时间与甘草酸对照品溶液相同，峰形均良好，且未见杂峰，表明该方法专属性良好。

图9 甘草酸的专属性考察Fig. 9 Specificity investigation of glycyrrhizic acid

2.3.5 线性关系考察 按“2.3.1” 项下方法制备不同浓度甘草酸对照品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样测定甘草酸峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得回归方程为Y＝0.086X－0.339，R2＝0.999，表明甘草酸在2.36～150.80 μg/mL 线性关系良好。

2.3.6 精密度考察 取“2.3.1” 项下甘草酸对照品母液按“2.3.3”项下色谱条件连续进样6 次测定甘草酸峰面积，计算RSD 值为0.89%，表明该仪器精密度符合实验要求。

2.3.7 重复性考察 按“2.3.2”项下方法平行制备6 份甘草酸凝胶供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样测定甘草酸峰面积，计算RSD 值为0.09%，表明该方法重复性良好。

2.3.8 稳定性考察 取同一甘草酸凝胶释放供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、16、24 h 时按“2.3.3”项下色谱条件进样测定甘草酸峰面积，计算RSD 值为0.45%，表明样品稳定性良好。

2.3.9 加样回收率考察 按“2.3.2”项下方法制备甘草酸溶胶，取甘草酸溶胶0.2 mL 于50 mL 量瓶中，加入200 μg/mL 甘草酸对照品溶液30 mL，滴加甲醇至刻度线得甘草酸加样回收率供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样测定甘草酸峰面积，计算甘草酸平均加样回收率为98.37%，RSD 值为0.96%，表明该方法加样回收率符合实验要求。

2.4 甘草酸凝胶的释放特性研究

分别制备5、10、30 mg/mL 甘草酸凝胶，取不同体积的含甘草酸45 mg 的各甘草酸凝胶于截留相对分子质量3500 的透析袋中，取pH 7.4 PBS 缓冲液片剂5 片溶于500 mL 纯净水制得PBS 缓冲液。以pH 7.4 PBS 缓冲液为释放介质，置于37 ℃恒温水浴摇床以100 r/min 振摇，分别于0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、18、24、36、72、96 h 吸取1 mL 释放介质，同时向释放介质中补足等温等体积的空白释放介质，按“2.3.3”项下色谱条件测定释放介质中甘草酸含量；另取各质量浓度甘草酸凝胶按“2.3.2”项下方法制备甘草酸凝胶供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件测定甘草酸凝胶中甘草酸总含量，计算各时间点甘草酸凝胶的累积释放率，绘制释放曲线图。不同质量浓度甘草酸凝胶的释放情况如图10 所示，不同质量浓度的甘草酸凝胶达到释放平衡的时间无明显差别，由此可见，甘草酸质量浓度的提高虽然能够增大甘草酸凝胶中网络结构的密度及缠结程度，但对于其达到累积释放平衡的时间无影响。30 mg/mL 甘草酸凝胶的释放速率较5、10 mg/mL 甘草酸凝胶的释放速率小，达到释放平衡阶段时的累积释放率随着甘草酸凝胶质量浓度的增大而减小。这可能是高质量浓度使甘草酸在透析袋中形成了在实验时间内无法分解释放的纳米纤维。

图10 不同质量浓度甘草酸凝胶的释放曲线 (±s, n = 3)Fig. 10 Release curve of glycyrrhizic acid gel with different concentrations (±s, n = 3)

2.5 HPLC 法测定橙皮苷含量

2.5.1 橙皮苷对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制得质量浓度为120.00 μg/mL 的橙皮苷对照品母液，取不同体积橙皮苷对照品母液加甲醇稀释得质量浓度分别为60.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.00 μg/mL 的橙皮苷对照品溶液。

2.5.2 供试品溶液的制备

（1）橙皮苷水溶液供试品溶液：取橙皮苷60 ℃水溶液/室温饱和水溶液/混悬液0.2 mL 于10 mL 量瓶中，滴加甲醇至刻度线并混匀，即得。

（2）橙皮苷-甘草酸凝胶供试品溶液：取橙皮苷-甘草酸凝胶于60 ℃下搅拌溶解得橙皮苷-甘草酸溶胶，取橙皮苷-甘草酸溶胶0.2 mL 于10 mL 量瓶中，滴加甲醇至刻度线并混匀，即得。

（3）橙皮苷释放供试品溶液：取橙皮苷室温饱和水溶液/橙皮苷-甘草酸凝胶释放介质1 mL，即得。

2.5.3 色谱条件 色谱柱为Waters XBridge Shield RP18C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（25∶75），等度洗脱；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长284 nm；理论塔板数均大于7000。

2.5.4 专属性考察 取橙皮苷室温饱和水溶液、橙皮苷-甘草酸凝胶释放样品按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，与“2.5.1”项下橙皮苷对照品母液、甲醇、PBS 缓冲液分别按“2.5.3”项下色谱条件进样分析，考察该方法的专属性，结果如图11 所示。结果表明，各样品溶液的出峰时间与橙皮苷对照品溶液相同，峰形均良好，且未见杂峰，表明该方法专属性良好。

图11 橙皮苷的专属性考察Fig. 11 Specificity investigation of hesperidin

2.5.5 线性关系考察 按“2.5.1”项下方法制备不同浓度橙皮苷对照品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件进样测定橙皮苷峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得回归方程为Y＝0.253X－0.031，R2＝0.999，结果表明橙皮苷在1.00～60.00 μg/mL 线性关系良好。

2.5.6 精密度考察 取“2.5.1”项下橙皮苷对照品母液按“2.5.3”项下色谱条件连续进样6 次测定橙皮苷峰面积，计算RSD 值为0.27%，表明该仪器精密度符合实验要求。

2.5.7 重复性考察 按“2.5.2”项下方法平行制备6 份橙皮苷-甘草酸凝胶供试品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件进样测定橙皮苷峰面积，计算RSD 值为0.26%，表明该方法重复性良好。

2.5.8 稳定性考察 取同一橙皮苷-甘草酸凝胶释放供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、16、24 h 时按“2.5.3”项下色谱条件进样测定橙皮苷峰面积，计算RSD 值为0.65%，表明样品稳定性良好。

2.5.9 加样回收率考察 按“2.5.2”项下方法制备橙皮苷-甘草酸溶胶，取橙皮苷-甘草酸溶胶0.2 mL于10 mL 量瓶中，加入100 μg/mL 橙皮苷对照品溶液0.25 mL，滴加甲醇至刻度线得橙皮苷加样回收率供试品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件进样测定橙皮苷峰面积，计算橙皮苷的平均加样回收率为97.81%，RSD 值为1.22%，表明该方法加样回收率符合实验要求。

2.6 甘草酸凝胶对橙皮苷的增溶效果考察

2.6.1 橙皮苷-甘草酸凝胶的制备 精密称取橙皮苷20 mg、甘草酸100 mg 于10 mL 水中，在60 ℃水浴下缓慢搅拌，溶解20 min，于6475×g离心5 min，取上清液于室温静置12 h 凝固，即得。

2.6.2 橙皮苷室温饱和水溶液的制备 精密称取橙皮苷20 mg 于10 mL 水中，在室温搅拌溶解24 h，将过饱和橙皮苷悬液过0.45 μm 滤膜，即得。

2.6.3 橙皮苷60 ℃水溶液的制备 精密称取橙皮苷20 mg 于10 mL 水中，在60 ℃水浴下缓慢搅拌溶解20 min，恢复至室温后，将过饱和橙皮苷悬液过0.45 μm 滤膜，即得。

2.6.4 不同溶解条件橙皮苷溶解能力的测定 取“2.6.1”项下橙皮苷-甘草酸凝胶、“2.6.2”项下橙皮苷室温饱和水溶液、“2.6.3”项下橙皮苷60 ℃水溶液按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件进样测定不同溶解条件下橙皮苷的溶解能力。实验结果（表6）表明，橙皮苷-甘草酸凝胶中橙皮苷溶解度最高，为橙皮苷室温平衡溶解度的5.91 倍，为60 ℃水浴20 min 溶解度的1.87 倍，表明甘草酸凝胶对橙皮苷具有一定的增溶作用，增溶的机制可能包括由甘草酸分子疏水基团朝内、亲水基团朝外所形成的中空纳米纤维为橙皮苷提供了较大的疏水性结构域，或甘草酸与橙皮苷形成主客体复合物从而提高橙皮苷的溶解度，除此之外，当甘草酸浓度达到临界胶束浓度以上时能够形成胶束，胶束能够通过包裹作用提高疏水性药物橙皮苷的溶解度。

表6 橙皮苷溶解能力 (±s, n = 3)Table 6 Solubility of hesperidin (±s, n = 3)

表6 橙皮苷溶解能力 (±s, n = 3)Table 6 Solubility of hesperidin (±s, n = 3)

组别 溶解度/(μg·mL-1)常温平衡24 h 21.47±1.10 60 ℃水浴20 min 67.84±2.22橙皮苷-甘草酸凝胶 126.95±2.83

2.7 橙皮苷-甘草酸凝胶中橙皮苷释放特性考察

2.7.1 橙皮苷混悬液的制备 精密称取12.70 mg橙皮苷于100 mL 纯净水中，室温搅拌溶解24 h 得127.00 μg/mL 橙皮苷混悬液。

2.7.2 橙皮苷溶液 精密称取12.70 mg 橙皮苷于10 mL 甲醇中溶解制得10 倍量橙皮苷甲醇母液，取橙皮苷甲醇母液2 mL 加纯净水稀释至20 mL 得127.00 μg/mL 橙皮苷溶液。

2.7.3 不同形式橙皮苷释放差异考察 分别取“2.6.1”项下橙皮苷-甘草酸凝胶、“2.7.1”项下橙皮苷混悬液、2.7.2”项下橙皮苷溶液1 mL 于截留相对分子质量3500 的透析袋中，以100 mL pH 7.4 的PBS 为释放介质，置于37 ℃恒温水浴摇床以100 r/min 振摇，分别于0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、10、12、24、48 h 吸取1 mL 释放介质，同时向释放介质中补足等温等体积的空白释放介质，按“2.5.3”项下色谱条件测定释放介质中橙皮苷含量；另取橙皮苷-甘草酸凝胶、橙皮苷混悬液、橙皮苷溶液按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件测定各样品中橙皮苷总含量，计算各时间橙皮苷-甘草酸凝胶中橙皮苷的累积释放率，绘制释放曲线图，结果如图12 所示。等体积、等含药量的橙皮苷溶液、橙皮苷-甘草酸凝胶达到释放平衡的累积释放率相近，而橙皮苷混悬液释放缓慢且平衡释放率低于30%，橙皮苷-甘草酸凝胶和橙皮苷溶液释放速率快且平衡释放率远高于橙皮苷混悬液；相较于橙皮苷溶液，橙皮苷-甘草酸凝胶具有明显的缓释作用。因此，橙皮苷-甘草酸凝胶能够显著改善橙皮苷分散性能，改善其释放率低的特点，并相较于橙皮苷溶液能够发挥一定程度的缓释作用。

图12 橙皮苷溶液、橙皮苷混悬液、橙皮苷-甘草酸凝胶释放曲线 (±s, n = 3)Fig. 12 Release curve of hesperidin solution, hesperidin suspension and hesperidin-glycyrrhizic acid gel (±s, n = 3)

3 讨论

基于自身分子结构的两亲性，甘草酸在水中能够通过分子间氢键及π-π 堆积作用形成螺旋状的甘草酸纳米纤维并进一步缠结形成甘草酸凝胶网络结构[22]，凝胶的流变学性质是分子间作用力和微观结构中纳米纤维间缠结程度的宏观表现。甘草酸分子中多个羟基及羧基的存在使得甘草酸分子间非共价键相互作用灵活多变，从而形成具有不同性质和微观结构的自组装体[23]。自组装体大多数由氢键及静电力驱动形成，因此pH 值、离子强度等客观条件对自组装体的形成具有重要影响。pH 值对甘草酸分子间氢键、静电力相互作用具有显著影响，表现为甘草酸溶解度的pH 值依赖性及其在不同pH 值的溶剂中的不同聚集形式。Matsuoka 等[24]研究表明，浓度为5 mmol/L 的甘草酸能够在pH 5 的溶剂中形成半径和长度分别为1.5 nm 和21 nm 的杆状胶束，在pH 7 的溶剂中则以单体形式存在，而金属离子能够通过其静电屏蔽效应及配位键影响水凝胶的流变学性质。

流变学研究中，η0能够反映凝胶未受剪切作用时所具有的真实黏度，γ侧面反映凝胶受到剪切作用时的强度。平台模量与凝胶纤维网络间的缠结密度呈正比，G′和G″的绝对大小反映凝胶的流动性，而损耗系数则能够反应凝胶的弹性和软硬程度。该研究结果表明，甘草酸凝胶的黏度、强度和弹性对凝胶中甘草酸质量浓度、溶剂pH 值、离子种类、离子质量浓度的变化敏感，且实验证明了甘草酸凝胶对模型药物橙皮苷的增溶及缓释作用，基于此，甘草酸凝胶有望作为药物载体用于外用制剂或新型递药系统的开发。在实际应用中，则需结合给药方法和生理状况，对甘草酸用量、溶剂pH 值或离子组成进行考察与选择，使甘草酸凝胶具备符合应用条件的黏度、弹性和强度。本研究丰富了甘草酸凝胶流变学性质的现有认识，为甘草酸在药学领域中的应用提供了更坚实的理论基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突