泽兰素缓解丙泊酚诱导的小鼠海马组织损伤的作用机制

周进国，白丽梅

（1.邯郸市第一医院麻醉科，河北 邯郸 056000；2.邯郸市第一医院东区急诊内科，河北 邯郸 056000）

丙泊酚具备促使神经元无序凋亡、抑制增殖等神经毒性，过量使用可引起海马组织损伤，并诱发认知功能障碍[1]。神经炎症、缺血再灌注损伤、氧自由基超载和TNF- /NF- B炎性因子异常激活等导致的神经细胞凋亡被公认为海马损伤病理过程的关键调控机制[2]，因此抑制缺血再灌注损伤及阻滞TNF- /NF- B 炎性因子表达成为治疗及预防丙泊酚麻醉损伤导致神经元受损保护的思路之一。

泽兰植物为唇形科地笋属植物毛叶地瓜儿苗（Lycopus lucidus Turcz.var. hirtus Regel）及地瓜儿苗（Lycopus lucidus Turcz.）茎上植物部分，毛叶地瓜儿苗的茎、苗、花和叶部分被收录于2010 年版《中国药典》（一部），被广泛用于活血调经，祛瘀消痈，利水消肿等方面；现代药理药学认为其具备抗凝血、活血化瘀、增加胆汁含量、熊去氧胆酸量、清除二苯代苦味酰肼和超氧阴离子自由基能力、兼具还原Fe3+能力及抑制脂质过氧化能力[3]。

研究表明，泽兰提取物具备调控PI3K/Akt 信号通路，下调HIF-1a 基因表达及其下游蛋白表达[4]，有效缓解急性缺氧导致的局灶性脑组织缺血损伤[5]，泽兰素可能在其中发挥关键作用，然而在丙泊酚麻醉损伤后脑神经保护与TNF- /NF- B 通路间的调节关系尚未被完全阐释。因此，该研究拟建立丙泊酚麻醉诱导的小鼠海马组织损伤模型，解析泽兰素对丙泊酚诱导的C57 小鼠海马神经细胞损伤及TNF- /NF- B 信号通路的关联机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物准备

SPF 级健康C57 小鼠，体质量35.0~70.0 g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司，动物许可证号：SYXK（京）2021-006。喂养环境：温度22.0~25.0 ℃，湿度45.0%~60.0%，光照12 h/阴暗12 h 循环。

1.2 试验耗材及仪器

泽兰素水提物532-48-9（CAS：YT70340，浓度为10.0%）购自北京伊塔生物科技有限公司；3-N-丁苯酞6066-49-5（货号：ESSMB00312, CAS：6066-49-5，规格：100mg）购自香港吉斯恩贝国际贸易有限公司；Mouse TNF- ELISA Kit [小鼠肿瘤坏死因子（TNF- ）ELISA 试剂盒（货号：70-EK282/3）]购自联科生物；小鼠核因子B 亚基p65（NF- B p65）ELISA 试剂盒（批号：EK-R37440）购自上海酶研生物科技有限公司；BDNF ELISA 试剂盒（批号：l110740）购自上海贝诺生物科技有限公司。

奥盛Feyond-A300 多功能酶联免疫分析仪（杭州奥盛）；Chemi-Doc XRS 型化学发光成像系统（Chemi Doc XRS+，BIO-RAD）。

1.3 试验方法

C57 成年小鼠60 只随机数法随机分组，丁苯酞阳性药物对照组（Dl-3-N-Butylphthalide，丁苯酞组，n=40）、泽兰素给药组（泽兰素组，n=40）和海马损伤模型组（模型组，n=40），通过50 mg/kg丙泊酚腹腔旋转注射方式诱导C57 成年小鼠海马组织脑损伤模型，依据已发表文献[4]的造模成功标准，试验鼠全部成功制备丙泊酚诱导海马损伤模型。另选取同批次小鼠作为空白对照组（空白组，n=40）。丁苯酞组、泽兰素组、模型组和空白组以腹腔旋转注射方式分别给予2 mg/kg丁苯酞、1.24 mL/kg 自备泽兰素混悬液1 mL、0.9%生理盐水1 mL和0.9%生理盐水1 mL，1 次/d，持续28 d。第29 天采用颈动脉脱臼法处死全部试验小鼠，剥离双侧脑实质组织，参照Shi 的方法[6]，ELISA 方法检测干预前及试验开始第28 天测定脑实质的TNF- /NF- B、BDNF 表达。

HE 染色，取试验鼠双侧脑实质组织于10.0%福尔马林液体中行酒精脱水、石蜡包埋，冠状切面取片，选择典型海马组织切片行脱蜡、水化及Nissl 染色液浸染30 min 后漂洗，100%pH=7.030 中性树胶后封闭10 min 后行纤维切片。

各组小鼠干预前、试验开始第28 天分别行水迷宫试验、神经功能评分和糖水偏好试验。水迷宫试验，设置室内平均噪声数低于25 分贝，随机选取4 处不同象限等间隔池壁入水点，各组小鼠分别独立依次从入水点放置，记录3 min内平台寻找时间、静置平台穿越频次，训练4 d，每天2 次，限定时间为2 min，训练间隔10min，记录逃避潜伏时长、对侧象限停留时间（s）和穿越初始平台频次。神经功能评分：依据Masso Shmiizu-Sasamata评价方法，在干预前、试验开始第28天两个时间节点依据动物神经行为记录神经损伤严重缺损评分。糖水偏好试验：在规定时间节点内对试验小鼠进行糖水偏好试验，分别给予每只试验小鼠1 瓶无菌蒸馏水和1 瓶质量分数为2.0%蔗糖溶液，24 h 后分别计算无菌蒸馏水及蔗糖溶液减少质量，统计小鼠糖水偏好指标。糖水偏好指标= 蔗糖水减少量/（蔗糖水减少量+无菌蒸馏水减少量） 100%。

1.4 观察指标

Nissl染色法检测大鼠海马组织神经元损伤程度；神经功能评分、Morris 水迷宫试验和糖水偏好试验3种试验方式检测干预前后神经 行为变化；ELISA 方法比较TNF- /NF- B、BNDF 水平。

1.5 统计学方案

所有数据采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t 检验，双尾检验，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色检测小鼠海马组织神经元损伤

泽兰素组、丁苯酞组和空白组大鼠神经元结构相对完整，边缘界限明确清晰，神经元突触圆润饱满，细胞核位于中央；模型组损伤处神经元皱起，边缘界限不清，组织纹理及结构紊乱，见图1。

图1 海马组织切片形态图（HE 染色，200 ）Fig.1 Morphological map of hippocampal tissue sections (HE staining,200 )

图2 各组糖水偏好试验指数变化百分比Fig.2 Percentage change in sugar preference test index by group

2.2 各组干预前后水迷宫试验指标变化

Morris水迷宫结果提示：与空白组比较，模型组单位逃避时间、对侧象限停留时间显著延长（P＜0.05）；泽兰素组、丁苯酞组单位逃避时间、对侧象限停留时间显著缩短（P ＜0.05）。模型组穿越初始平台频次显著减少，泽兰素组、丁苯酞组显著增加（P ＜0.05）。与模型组比较，泽兰素组、丁苯酞组单位逃避时间、对侧象限停留时间显著缩短、穿越初始平台频次明显增加（P＜0.05），见表1。

表1 各组干预前后水迷宫试验指标变化（n=40）Table 1 Changes in water maze experimental indicators before and after intervention in each group

2.3 各组干预前后模型组神经功能评分变化

与试验前相比，试验后泽兰素组、丁苯酞组神经功能缺损程度评分明显下降（P ＜0.05）；模型组评分比较则无明显差异（P ＞0.05）。试验后Masao Shmiizu-Sasamata 神经功能评分比较中发现，与模型组相比，泽兰素组、丁苯酞组评分下降，差异显著（P ＜0.05），见表2。

表2 各组神经功能评分干预前后的变化（n=40）Table 2 Changes of neurological function scores in each group before and after intervention

2.4 各组干预前后糖水偏好试验评价

与模型组相比，泽兰素组、丁苯酞组糖水偏好试验指数明显上升，差异（P＜0.05）。与阳性药物丁苯酞组相比，泽兰素组糖水偏好试验指数略显降低，但差异不显著（P ＞0.05）。

2.5 ELISA检验TNF- /NF- B、BNDF水平

表3 结果显示，与空白组相比，泽兰素组、丁苯酞组NF- B、BNDF 明显上升，TNF- 明显下降，差异极显著（P ＜0.01）；与模型组相比，泽兰素组、丁苯酞组NF- B、BNDF明显上升，TNF- 明显下降，差异显著（P＜0.05）。

表3 ELISA 检验TNF- ，NF- B 和BNDF 的表达水平（n=40）Table 3 Detection of expression level of TNF- ,NF- B and BNDF by ELISA

3 讨论

过量丙泊酚可过度激活海马CA1 区谷氨酸受体导致调控功能障碍[7,8]，可导致空间认知功能障碍及可逆性记忆减退。泽兰水提取物能减轻神经元细胞氧化应激、自由基超载和抑制炎症因子表达，减少神经元缺血再灌注损伤等作用，其分子机制之一为促进PI3K/Akt Pathway 及其下游HIF-1a 从而发挥拮抗ROS 等因子表达[9-11]，因此，泽兰素理论上具备延缓丙泊酚海马CA1 区受体损伤的作用，然而机制尚未探明。研究表明，NF- B 作为Rel 蛋白家族内多向性转录调节，是TLR4/MyD88信号通路调控节点，可发挥转录IL-1 、IL-8 和TNF- 调控，激活炎症因子表达，并抑制神经元细胞炎症凋亡[12-14]；TNF- 可降低海马神经元突触间传递效率[15]，增强TNF- 受体疼痛遗忘效应并降低突触可塑性[16]；BDNF 可作为脑神经元神经保护的功能性指标之一，具备维持神经元突触塑造、调控分化及神经电生理损伤后再修复等功能，反应海马组织丙泊酚类化学药物损伤再修复程度[17-20]。

海马麻醉损伤往往导致快感丧失，经典糖水偏好试验常用作衡量海马受损抑郁状态程度的重要指标之一。本研究通过对海马损伤模型小鼠进行丙泊酚麻醉处理方式建立海马麻醉损伤模型，使用阳性对照药物丁苯酞、泽兰素对模型鼠进行试验。Morris水迷宫检测结果显示，泽兰素组单位逃避时间、对侧象限停留时间显著缩短和穿越初始平台频次明显增加，这表明泽兰素提高了空间记忆巩固能力及记忆提取的精确性。糖水偏好试验则证实，泽兰素可有效增强对抗抑郁行为，缓解海马损伤大鼠认知功能的受损。

泽兰素可使脑海马组织内TNF- 、BNDF 表达升高，NF- B 表达降低，此项结果表明，泽兰素在增强突触传递效率、脑神经保护及TNF 受体调控突触可塑性方面具备一定效应，验证了泽兰素对丙泊酚药物麻醉损伤海马功能的保护作用。

泽兰素可显著上调NF- B、BNDF 蛋白表达，抑制TNF- 合成和释放，增强神经元功能恢复，强化小鼠的空间规划及瞬时记忆能力，协助抗抑郁，以缓解小鼠丙泊酚诱导的海马组织损伤。