铜离子对牙髓组织再生能力的影响及其机制初探

伍 玉,杨磊婷,江 飞,周芷萱,沈 铭

不可复性牙髓炎是口腔临床常见问题。由于被无让性的牙本质包绕,牙髓组织难以通过有效侧支血供自我修复,炎症牙髓只能被摘除以保存患牙[1]。然而,根管治疗后的牙体组织会因失去牙髓滋养而出现易折、易变色、牙根发育停止(年轻恒牙)等并发症[2]。因此,组织工程牙髓再生成为研究热点[3-4]。来源于神经嵴的牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有很强的细胞增殖能力及多向分化潜能[5-6],是牙髓组织再生应用中理想的种子细胞。

色素框同源蛋白7(chromobox protein homolog 7,CBX7)为多梳抑制复合物1(polycomb repressive complex 1,PRC1)的关键亚基,是参与细胞周期调控的转录抑制因子[7]。低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)能直接结合cbx7启动子区、内源性上调CBX7,通过HIF-1α-CBX7级联效应促进干细胞自我更新、维持干细胞特性[8]。有研究证实,铜离子是人体内具有生物活性的微量元素,能通过模拟乏氧环境,在刺激细胞活化HIF-1α的同时,还能大量分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)诱导血管新生[9]。本文主要探讨铜离子能否在DPSCs中通过活化HIF-1α增加CBX7的表达和血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的分泌,进而在牙髓组织再生过程中发挥重要作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

1.1.1 实验动物 本研究使用5只8周龄的雄性BALB/c裸鼠,由南京医科大学实验动物中心提供(饲养协议编号:SY20200050)。动物的使用经南京医科大学动物护理和使用委员会批准(动物实验伦理编号:IACUC 2005034-1)。

1.1.2 实验试剂与仪器 α-MEM培养基、青霉素-链霉素-两性霉素B(Gibco,美国),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Cellmax,美国),磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)、ECL发光底物(Biosharp,中国),CCK-8试剂盒(同仁,日本),Fibrinogen(Sigma,美国),Calcein-AM/PI活死细胞双染试剂盒(翊圣,中国),高纯总RNA快速提取试剂盒(百泰克,中国),HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞,中国),蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(APExBIO,美国),PVDF转印膜(Millipore,美国),HIF-1α一抗、CBX7一抗、Sox-2一抗、GAPDH一抗(Proteintech,美国),Oct-4一抗、Nanog一抗(Abcam,英国),ECM培养基(Sciencell,美国),matrigel matrix(Corning,美国),柠檬酸缓冲液干粉(Coollaber,中国)。多功能酶标仪(Tanon,中国),化学发光凝胶成像系统(Tanon,中国),ABI荧光定量PCR仪(Applied Biosystems,英国),正置荧光显微镜(Leica,德国)。

1.2 细胞来源及培养

DPSCs从15～25周岁年轻人需要拔除的前磨牙牙髓或阻生牙牙髓中获取(伦理审批号No.2021-177,南京医科大学)。涡轮机磨切牙颈部,在超净台中用拔牙钳掰开牙齿,用拔髓针拔出冠髓、根髓并置于培养皿中。用含有10%青霉素-链霉素-两性霉素B的PBS冲洗牙髓组织3遍,并剪碎牙髓组织。盖玻片四角抹蘸灭菌凡士林后,将已剪碎的牙髓组织压于新培养皿底。培养皿中加入α-MEM完全培养基,于37 ℃,5% CO2的孵箱中静置1周,待细胞从组织中爬出。原代DPSCs爬出后,每48～72 h换1次液,按正常细胞培养方式培养、传代。

1.3 CCK-8法测定细胞增殖

称取63.93 mg CuCl2·2H2O,用15 mL ddH2O溶解,0.22 μm的滤器过滤,分装,4 ℃冰箱保存,使用时用完全培养基稀释至相应的浓度即为含铜离子的完全培养基。在96孔板中接种第3代DPSCs悬液100 μL(2×103个细胞/孔)。细胞贴壁后换成含5、25、50、100、200 μmol/L铜离子的完全培养基,Control组不含铜离子。将培养板放在孵箱中培养1、3、7、14 d。到相应时间点时,避光环境下向相应孔中加入10 μL CCK-8溶液,培养箱内孵育2 h后用酶标仪测定450 nm处的光密度值。

1.4 水凝胶毒性检测

用PBS配制终质量浓度为5 mg/mL的人来源Fibrinogen溶液,并用0.22 μm的滤器过滤后备用。按每100 μL体系用1 μL 50 U/mL的凝血酶将Fibrinogen催化后,均匀铺在24孔板底部,每孔500 μL。待胶凝固后用含5、25、50 μmol/L铜离子或不含铜离子的完全培养基按1.5×104个/孔接种DPSCs细胞悬液500 μL,每2～3 d换1次液,培养14 d后根据Calcein-AM/PI活死细胞双染试剂盒说明书操作步骤操作并于倒置荧光显微镜下拍照。

1.5 Western blotting检测

第3代DPSCs以2.5×105个/孔接种于6孔板中,待细胞贴壁后更换含5、25、50 μmol/L铜离子的完全培养基,培养7 d和14 d后用RIPA缓冲液与蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物配制的裂解液提取细胞总蛋白。使用10% SDS-PAGE凝胶分离总蛋白(10 μg)后,将其转移到PVDF膜上,然后在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h,HIF-1α一抗(稀释比例1∶1 000)、CBX7一抗(稀释比例1∶1 000)、Sox-2一抗(稀释比例1∶3 000)、Oct-4一抗(稀释比例1∶1 000)、Nanog一抗(稀释比例1∶1 000)和GAPDH一抗(稀释比例1∶1 000)孵育过夜。第2天将PVDF膜置于TBST溶液摇床5 min,3次后放到相应二抗溶液中室温孵育1 h(二抗使用TBS溶液1:10 000稀释),最后滴加ECL发光底物显示蛋白质条带。通过Image J软件计算条带的强度。

1.6 实时定量PCR(qPCR)

细胞接种同上,培养7 d和14 d后按照高纯总RNA快速提取试剂盒说明书提取细胞总RNA,然后按HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR说明合成cDNA。ABI荧光定量PCR仪检测cDNA用来分析与干细胞特性、血管生成相关的mRNA表达情况。本研究使用的引物序列如表1所示,β-Actin用作内参。

表1 引物序列

1.7 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)成管实验

将第3代的DPSCs以1×106个/mL密度接种于10 cm2培养皿中,待细胞贴壁后更换为含5、25、50 μmol/L铜离子的完全培养基,待细胞汇合度达80%左右时,换成无血清的α-MEM基础培养基,24 h后吸出培养液制备DPSCs条件培养基。第1天将matrigel由-20 ℃取出,放入4 ℃冰箱过夜。第2天将matrigel置于冰上,枪头盒及96孔板也提前置于冰盒上预冷。每孔加入50 μL matrigel,并在37 ℃孵箱中放置30 min。胰酶消化并用ECM完全培养基重悬HUVECs。实验组使用80% DPSCs条件培养基将细胞浓度调整到3×104个/孔接种于96孔板,每孔100 μL;对照组使用80% α-MEM基础培养基稀释细胞,每组重复3孔。37 ℃孵箱孵育,每3 h在倒置显微镜下观察一次成管情况并拍照,使用Image J测量小管节点数及分支长度,并统计分析。

1.8 HUVECs迁移实验

24孔板下室以2×104个/孔接种第3代DPSCs,贴壁后更换含5、25、50 μmol/L铜离子的完全培养基,待汇合度达80%时接种5×103个/孔HUVECs于24孔板transwell小室的上室。HUVECs在制备细胞悬液前先让细胞撤血清饥饿24 h,去除血清的影响。消化细胞,终止消化后离心弃培养液,用无血清ECM培养基重悬。常规培养24～48 h后取出小室,4%多聚甲醛固定小室底面15 min,PBS洗3遍。结晶紫染色5 min后用超纯水洗去多余染色剂,干燥后正置显微镜下拍摄,统计分析。

1.9 负载DPSCs的含铜离子水凝胶体内生物学性能检测

将大皿中的DPSCs消化后调整细胞密度至9×106个/mL,与10 mg/mL Fibrinogen溶液按1∶1比例进行预混,以每100 μL体系加入1 μL 50 U/mL的凝血酶催化Fibrinogen溶液,在未成胶前注射于裸鼠背部皮下。实验组分为2组,分别为:①DPSCs/水凝胶组;②DPSCs/铜离子水凝胶组,含25 μmol/L铜离子。于术后14 d取材,通过苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色检测细胞的自我更新和血管新生情况。

1.10 IHC染色

安乐死实验鼠后取出皮下细胞团块,标本经10%甲醛固定24 h后,流水冲洗4 h,乙醇脱水,将样品石蜡包埋并以5 μm的厚度切片。石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化后,放入1×柠檬酸盐缓冲溶液中水浴加热10 min,室温冷却。用3% H2O2处理切片15 min以去除内源性过氧化氢酶,山羊血清封闭1 h,然后滴加适量一抗,置于湿盒中4 ℃孵育过夜。第2天将切片在PBS中洗涤3次,并根据一抗滴加相应二抗,室温孵育20 min,DAB显色,最后苏木素染核,脱水封片。正置显微镜下拍摄后,Image J统计阳性区域。

1.11 统计学分析

采用两个独立样本t检验和单因素方差分析实验数据,所有统计分析均使用GraphPad Prism 9软件进行。所有实验均重复3次及以上,结果以平均值±标准差(SD)表示,P<0.05认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度铜离子对DPSCs的毒性检测

为了检测不同浓度铜离子对DPSCs的毒性,将第三代DPSCs在不同浓度的铜离子中培养1、3、7、14 d后通过CCK-8检测细胞毒性,结果显示浓度为100 μmol/L和200 μmol/L时DPSCs增殖呈现比较明显的抑制,提示可能浓度过高存在毒性。与对照组比较,5、25、50 μmol/L对DPSCs无显著毒性作用(图1A)。同时,在含铜离子水凝胶培养体系中,与含铜离子浓度为5、25、50 μmol/L铜离子的水凝胶接触培养的DPSCs存活良好,与对照组凝胶中细胞状态无差;经过14 d培养,水凝胶基本完全降解,细胞贴壁生长(图1B、C)。

A:CCK-8检测不同浓度铜离子对DPSCs的毒性作用;B、C:含5、25、50 μmol/L铜离子的水凝胶接触式培养DPSCs 14 d后活细胞(绿色)与死细胞(红色)染色及统计情况( ×100);与Control组相比,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001

2.2 铜离子刺激DPSCs后HIF-1α、CBX7的表达情况

Western blotting和qPCR技术检测质量浓度为5、25、50 μmol/L的铜离子在刺激DPSCs 7 d和14 d后HIF-1α和CBX7的表达水平,结果显示铜离子能够激活DPSCs中的HIF-1α,上调内源性CBX7,其中铜离子质量浓度为25 μmol/L时,激活HIF-1α、上调CBX7效果最明显(图2A～E)。

A～C:Western blotting检测DPSCs中HIF-1α和CBX7的蛋白表达水平;D～E:qPCR检测DPSCs中HIF-1α和CBX7的mRNA表达水平;与Control组相比,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001

2.3 铜离子刺激DPSCs上调CBX7后,干细胞特性指标的表达情况

通过Western blotting和qPCR检测经5、25、50 μmol/L质量浓度的铜离子刺激后干细胞特性相关基因的蛋白和mRNA在DPSCs中的表达情况,结果显示铜离子诱导7、14 d能够促进DPSCs中CBX7表达,上调Sox-2、Oct-4、Nanog,且铜离子浓度为25 μmol/L时DPSCs的干细胞特性指标上调最显著(图3A～G),这表明合适浓度的铜离子能够促进DPSCs干细胞特性的维持。

A～D:Western blotting检测DPSCs中Sox-2、Oct-4和Nanog的蛋白表达水平;E～G:qPCR检测DPSCs中Sox-2、Oct-4和Nanog的mRNA表达水平;与Control组相比,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001

2.4 铜离子刺激DPSCs后成血管表型变化

为了研究铜离子刺激DPSCs后对HUVECs血管形成有无促进作用,我们检测了DPSCs中VEGFA的基因表达情况, 结果显示25 μmol/L铜离子刺激的DPSCs中VEGFA表达最高(图4B)。考虑到DPSCs分泌的VEGFA可能增强促血管生成潜能,我们随后进行了血管形成实验。观察到25 μmol/L铜离子组中成管作用最显著(图4A、C、D)。当将25 μmol/L铜离子刺激下的DPSCs与HUVECs共培养24 h和48 h后,HUVECs迁移穿过transwell膜的数量也最多(图4E、F)。这些结果表明铜离子除维持DPSCs干性的同时,还可激活DPSCs发挥促血管化旁分泌作用。

A,C,D:铜离子刺激后的DPSCs条件培养基对HUVECs成管能力的影响( ×40);B:qPCR检测DPSCs中VEGFA的mRNA表达水平;E,F:DPSCs与HUVECs共培养24 h、48 h后HUVECs的迁移情况( ×100);与Control组相比,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001

2.5 负载DPSCs的含铜离子水凝胶的初步生物学性能验证

为了体内验证含铜离子水凝胶的生物学性能,在裸鼠皮下分别注射负载DPSCs的含25 μmol/L铜离子或不含铜离子水凝胶,14 d后可见注入物与周围组织相容性良好、注入物内部凝胶降解完全。含铜离子组材料内部出现新生血管样组织,且组织内干细胞特性指标Sox-2的阳性细胞比例显著增加(图5)。初步实验结果显示含铜离子水凝胶具有良好的生物相容性和降解性,能够维持被移植的DPSCs干细胞特性;促进DPSCs发挥促血管化旁分泌作用,诱导局部组织快速血管化。因此,含铜离子水凝胶作为支架材料对于血管化的功能性牙髓组织再生具有一定可行性。

注射负载 DPSCs 的铜离子水凝胶14 d后取样时大体图、石蜡切片HE染色( ×50)及SMA、Sox-2免疫组化染色( ×400);①DPSCs/水凝胶组;②DPSCs/含铜离子水凝胶组;与Control组相比,***:P<0.001

3 讨 论

牙髓组织在牙齿的矿化和敏感性维持中发挥重要作用[10]。但常规的根管治疗由于去除了炎症牙髓组织,进而导致由牙齿内环境平衡的破坏[11]。因此,牙髓再生对于恢复牙齿活力至关重要。有研究将体外收集、扩增形成的自体DPSCs细胞聚集体植入外伤性年轻恒切牙根管中,发现DPSCs细胞聚集体在无支架材料的条件下原位再生牙髓组织,恢复部分牙髓功能,促进根尖发育[12]。但该研究对象为年轻恒切牙,其根管相对较粗、根尖孔未闭合,易于细胞聚集体的植入和血运重建,而从成人牙髓组织分离获得的DPSCs中只有少部分具有很强的细胞增殖能力及分化潜能,且较难维持干细胞特性。同时,发育正常的恒牙根管相对较细,其根尖孔作为牙髓唯一的血供来源直径为0.20～0.63 mm[13],这一解剖因素不利于种子细胞的植入以及血运重建。因此,在本研究中,我们提出了一种优化策略,使用可注射的含铜离子水凝胶作为DPSCs的牙髓递送载体,不仅可以维持移植的DPSCs保持良好干细胞特性,还可以快速地诱导根尖孔至根管内的血运重建,最终重建牙髓组织正常生理功能。

铜离子具有较强的促进血管新生的作用[14]。其通过激活HIF-1α和增加VEGF的分泌,显著增强缺氧样反应,对人骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells,hBMSCs)具有明显的促进血管新生作用等[9]。在我们的实验中,25 μmol/L浓度的铜离子可在体外上调DPSCs中HIF-1α的表达,进而使VEGFA的表达水平增高。相应地,血管生成实验表明,铜离子刺激DPSCs分泌的VEGFA增强了HUVECs的血管生成潜能,与对照组相比,铜离子刺激的DPSCs的条件培养基可以强烈募集HUVECs。这一结果表明铜离子能促进DPSCs发挥促血管化的旁分泌作用,铜离子与DPSCs诱导的微环境有利于血运重建。

干细胞提取、培养、移植会刺激干细胞分化,如何维持DPSCs的干细胞特性,从而再生出具有良好生理功能牙髓组织,是牙髓再生的难点。大量研究表明,CBX7在维持干细胞特性方面具有重要意义。在小鼠胚胎干细胞中,CBX7的高表达能够上调干细胞中的Sox-2、Oct-4和Nanog[15],这些多潜能转录因子在胚胎干细胞和成体干细胞的自我更新和干细胞特性维持中发挥关键作用[16-17],同时这些转录因子还可诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)形成,维持细胞全能性[18];在成体多能样嗅觉干细胞亚群(adult olfactory cell population,APOSCs)中,cbx7+/+APOSCs对自发性或损伤性诱导的组织再生反应迅速,而cbx7-/-APOSCs自我更新和分化潜能受损[19];在人正常和恶性造血干细胞中,CBX7表达增加并整合入PRC1聚合物时会加快细胞自我更新甚至诱发白血病[20];在胃癌干细胞中,CBX7通过抑制p16表达、同时激活蛋白激酶B/核因子κB(Akt/NF-κB)上调miR-21,增加胃癌细胞干细胞样特性[21]。为了验证铜离子刺激DPSCs后是否也能增加CBX7的表达,维持DPSCs干细胞特性,以利于功能性牙髓组织再生,我们通过Western blotting和qPCR检测CBX7、Sox-2、Oct-4和Nanog在体外的表达情况,结果显示25 μmol/L铜离子可以在体外上调DPSCs的CBX7,增加Sox-2、Oct-4和Nanog的表达。因此,我们认为铜离子除激活DPSCs发挥促血管化旁分泌作用的同时,还可维持DPSCs的干细胞特性,达到提升DPSCs再生潜能的效果。

成熟恒牙根管的三维空间结构狭窄复杂,很难重建血液供应。根尖孔较大的年轻恒牙被认为是可能进行牙髓再生的牙齿类型。然而有研究表明当根尖孔缩窄至1 mm,根管长度缩窄至11 mm时,包裹有促血管生成因子的可注射支架可帮助实现完全的牙髓血管化再生[22]。我们课题组曾用纤维蛋白水凝胶立体培养人胚胎羊膜干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs),并将负载hAMSCs的纤维蛋白水凝胶植入兔上颌窦提升区、颅顶骨缺损区,均获得局部相应组织再生[23-24]。与二维平面培养相比,水凝胶构建的立体培养体系能模拟细胞体内生长微环境,维持细胞活性,还能类似胞外基质支撑微血管形成[14]。为了既方便DPSCs递送,又可负载水溶性铜离子,并能构建可维持DPSCs干细胞特性的血管化微环境,我们在先前研究的基础上,制备了具有一定流动性的负载DPSCs的含铜离子水凝胶材料并注射至裸鼠皮下14 d,结果发现水凝胶被完全吸收,并且在负载DPSCs的含铜离子水凝胶中观察到SMA和Sox-2阳性染色的细胞明显增多。因此,基于我们细胞及体内研究的结果,我们初步明确了负载DPSCs的含铜离子水凝胶可在促牙髓组织再生中发挥重要作用,虽然未达到原位牙髓再生的效果,且再生表型还有待在大型动物的根管模型内进一步验证,但这也为临床促进牙髓再生提供了新思路。

综上所述,本研究初步验证了铜离子刺激DPSCs活化乏氧信号HIF-1α后,一方面能使CBX7表达水平升高,进而上调Sox-2、Oct-4和Nanog,维持DPSCs干细胞特性,获得具有分化潜能的牙髓组织;另一方面能促进VEGFA分泌,诱导血管新生,促进新生组织快速血管化。同时通过体内实验初步验证了负载DPSCs的含铜离子水凝胶的生物学性能,为再生功能性牙髓组织提供理论和实验依据。