Nrf2/HO-1 通路在腹腔注射红景天苷缓解小鼠骨癌痛中的作用 *

沐浴阳 李冰洁 付邱月 韩明明 李 娟 康 芳 ,△

（1 安徽医科大学附属省立医院麻醉科，合肥 230036；2 中国科学技术大学附属第一医院麻醉科，合肥 230036）

骨癌痛 (bone cancer pain, BCP) 常发生在癌症晚期的骨转移病人中[1]。BCP 是一种由于肿瘤生长和骨质破坏引起的，涉及炎性、神经病理性、肿瘤特异性机制的复杂、顽固的慢性疼痛，具有触诱发痛和痛觉过敏的特征[2]。目前针对BCP 的治疗十分棘手，缺乏安全有效的治疗药物和措施[3]，主要原因是其具体发生机制尚未完全阐明[4]。因此，探寻BCP 的发病机制，以发现新的靶点或药物，从而阻断BCP 的发生或进展，是目前亟待解决的重大问题。

红景天苷是从红景天中提炼的重要活性成分，具有抗炎和保护肾脏的作用[5]。既往的研究证实，红景天苷可以有效缓解神经病理性疼痛[6]。然而，红景天苷是否可以用于缓解BCP，目前国内外尚没有相关报道。

核因子红系相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2) 是一种转录因子，负责调节细胞的抗氧化能力，血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1) 是Nrf2 靶控的基因之一[7]。Nrf2 可促进HO-1 表达并参与神经病理性疼痛的发生，腹腔注射奥替普拉（一种选择性Nrf2 激动剂）通过活化Nrf2/HO-1 通路缓解大鼠的痛觉过敏，而葫芦巴碱（一种选择性Nrf2 拮抗剂）可逆转奥替普拉的镇痛作用[8]。此外，Nrf2 在大鼠BCP 的进展中也发挥着重要作用，活化的Nrf2 可通过上调HO-1 减轻炎症级联反应，进而缓解大鼠BCP[9]。且既往的研究发现红景天苷在疾病中可充当Nrf2/HO-1 通路激动剂的角色[10,11]。因此，我们假设Nrf2/HO-1 通路介导红景天苷在BCP中的作用。本研究拟采用小鼠BCP 模型，观察红景天苷对BCP 的影响，并探讨Nrf2/HO-1 通路是否介导这种作用，为BCP 的治疗靶点提供依据。

方 法

1.实验动物

雄性C57BL/6 小鼠（6～ 8 周龄，体重18～ 22 g），由中国科学技术大学附属第一医院动物实验中心提供，小鼠在室温 (25±2℃) 条件下饲养，维持昼夜节律 (12 h/12 h)，可自由获取水和食物。动物实验已通过中国科学技术大学附属第一医院实验动物伦理会审查（动物伦理审批号：2022-N(A)-071）。

2.主要试剂与仪器

红景天苷（T2717，美国TargetMol）、葫芦巴碱（T2887，美国TargetMol）、Nrf2 抗体（16396-1-AP，武汉三鹰）、HO-1 抗体（10701-1-AP，武汉三鹰）、β-tubulin 抗体（M20005，上海艾比玛特）、vonFrey机械测痛仪（美国加州North Coast Medical）、热辐射刺激仪（上海玉研）、电泳仪（北京六一）、转膜仪（北京六一）、超灵敏多功能成像仪（美国GE）和共聚焦荧光显微镜（德国Zeiss）等。

3.建立BCP 模型

根据既往的研究方法建立BCP 模型[12]。小鼠在吸入3%异氟醚麻醉后，被仰卧固定于动物操作台上。接着消毒铺巾，用外科剪或动物剃毛器除去小鼠右膝关节处毛发，无菌手术刀切开皮肤，微血管钳钝性分离肌肉组织，充分暴露出膝关节。牙钻垂直刺破股骨远端内外髁之间的骨皮质，进入骨髓腔，直至牙科钻固定，然后缓慢退出牙科钻。用25 μl 微量注射器将混有2×105个路易斯肺癌 (lewis lung carcinoma, LLC) 细胞的10 μl 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline, PBS) 沿牙科钻留下的孔缓慢注入小鼠股骨远端骨髓腔内。Sham 组接种10 μl PBS（不含LLC 细胞）。用骨蜡封住注射孔，缝合手术部位，青霉素钠均匀涂抹于切口周围，然后将小鼠放置在保温毯上进行麻醉复苏，待小鼠完全苏醒后放回饲养箱内。本实验造模共使用100 只C57BL/6 小鼠，造模成功率为80%。

4.实验分组与处理

（1）将20 只小鼠按随机数字表法分为假手术组（Sham 组，n= 10）和BCP 组 (n= 10)。两组小鼠在接种LLC 细胞后第0、7、14 和21 天分别测定机械刺激缩足阈值 (mechanical withdrawal threshold,MWT) 和热刺激缩足反射潜伏期 (thermal withdrawal latency, TWL) (n= 8)。两组小鼠在接种LLC 细胞后第21 天测定MWT 和TWL 后取右侧股骨行HE 染色。

（2）将40 只小鼠制作成BCP 模型，在接种LLC 细 胞 后 第0 天(n= 10)、7 天(n= 10)、14 天(n= 10) 和21 天 (n= 10) 取出小鼠的脊髓腰段膨大(L3～L5)，采用Western Blot (n= 4) 和免疫荧光染色(n= 4) 检测其中Nrf2 和HO-1 的表达。

（3）将40 只小鼠随机分为Sham 组 (n= 10)、BCP 组 (n= 10)、BCP + 红景天苷（红景天苷）组(n= 10) 和BCP + 红景天苷 + 葫芦巴碱（红景天苷 + 葫芦巴碱）组 (n= 10)。在接种LLC 细胞后第14～21 天连续腹腔给药，并在腹腔给药1 h 后进行MWT 和TWL 测定，然后取出小鼠的脊髓腰段膨大(L3～L5)，采用Western Blot (n= 4) 和免疫荧光染色(n= 4) 检测其中Nrf2 和HO-1 的表达。

5.药物注射

红景天苷和葫芦巴碱溶解于10%二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO) 中，分别配制成浓度为10 mg/ml 的红景天苷试剂液和浓度为2 mg/ml 的葫芦巴碱试剂液备用。结合既往的研究[6,8,13]和我们的预实验结果，剂量为100 mg/kg 的红景天苷在接种LLC 细胞后第14～21 天以腹腔注射的方式连续注入红景天苷组小鼠体内，剂量为20 mg/kg 的葫芦巴碱在接种LLC 细胞后第14～21 天（在给予红景天苷前30 min）以腹腔注射的方式连续注入红景天苷 +葫芦巴碱组小鼠体内。Sham 组和BCP 组小鼠腹腔注入等量10% DMSO。

6.痛行为学检测

vonFrey 机械测痛仪用于测定MWT。根据既往的研究方法[12]，在安静环境下，将小鼠置于底部为铁丝网格 (1 cm×1 cm) 的有机玻璃箱 (10 cm×10 cm×15 cm) 中，适应30 min 后开始测量。vonFrey 纤维丝（0.16、0.4、0.6、1.0、1.4 和2.0 g）垂直施压于小鼠右后爪正中央并保持6～8 s。对vonFrey 纤维丝刺激的突然缩爪或舔舐被认为是阳性反应，每个克数的细丝均测量5 次，每次测量间隔至少10 s，产生3 次阳性反应所需的最小克数被记录为MWT (g)。

热辐射刺激仪用于测定TWL。根据既往的研究方法[12]，在安静环境下，将小鼠置于底部为玻璃平台 (56.5 cm×38 cm×0.3 cm) 的有机玻璃隔室(9 cm×6 cm×6 cm) 中，适应30 min 后开始测量。将热辐射刺激仪置于玻璃平台下方，光源垂直聚焦于小鼠右后爪表面。光源照射的最长时间设置为20 s，以避免小鼠组织烧伤。对热辐射刺激的突然缩爪或舔舐被认为是阳性反应，每只小鼠进行5 次测量，每次测量间隔至少5 min，记录产生阳性反应所需的时间，5 次结果的平均值被记录为TWL (s)。

7.HE 染色

在接种LLC 细胞后第21 天处死小鼠。取出小鼠的右侧股骨，用4%多聚甲醛固定组织，4℃过夜；接着连续脱钙3 周，每周更换1 次脱钙液，以细针能够刺入为终止脱钙的标准。脱钙的股骨用PBS 润洗后经石蜡包埋和连续切片，切片经二甲苯脱蜡，酒精脱水；然后对组织切片进行HE 染色，用中性树脂封片后，在光镜下观察股骨的组织形态。

8.Western Blot

小鼠3%异氟烷深麻醉后，迅速取出脊髓腰段膨大 (L3～L5)，BCA 法测定蛋白浓度。每孔上样40 μg 蛋白至SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，Nrf2 抗体 (1:1000)、HO-1 抗体(1:1000) 和β-tubulin 抗体 (1:10000) 4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，然后使用增强化学发光法显影。Image J软件进行分析，目的蛋白条带灰度值与β-tubulin条带灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。

9.免疫荧光染色

取出沉糖的脊髓，用吸水纸吸干表面的水分，OCT 固定剂包埋，置于冷冻切片机中冰冻30 min，然后将脊髓固定开始连续横向切片，切片保存备用；取出冷冻切片，复温20 min，免疫荧光笔围绕脊髓画圈防止液体流失，10%山羊血清（山羊血清: PBS = 1:9）室温封闭1 h，轻轻甩去封闭液，滴加10%山羊血清稀释过的Nrf2 (1:200) 和HO-1 抗体 (1:200)，放在避光湿盒中，4℃过夜；取出切片，复温20 min，加入对应二抗，孵育1 h，在脊髓片上滴少量DAPI，放盖玻片，在共聚焦荧光显微镜下观察并采集图像。

10.统计学分析

结 果

1.BCP 模型的成功建立

痛行为学结果显示，BCP 组小鼠在接种LLC细胞后第7、14 和21 天的MWT 和TWL 均明显低于Sham 组（P< 0.001，见图1A, 1B）。HE 染色结果表明，Sham 组小鼠股骨髓腔可见正常骨小梁（见图1C），而在接种LLC 细胞后第21 天，BCP 组小鼠股骨的骨小梁结构被完全破坏，并被肿瘤细胞所侵袭（见图1D）。这些结果表明BCP 模型建立成功。

图1 建立小鼠BCP 模型 (n = 8,±SD, two-way ANOVA)(A, B) Sham 组和BCP 组在接种LLC 细胞后第0、7、14 和21 天的MWT 和TWL；(C) Sham 组在接种LLC 细胞后第21 天的骨组织学（HE 染色，400×），骨小梁（箭头）；(D) BCP 组在接种LLC 细胞后第21 天的骨组织学（HE染色，400×），浸润的癌细胞（箭头）。标尺= 100 μm***P < 0.001，与Sham 组相比Fig.1 The establishment of BCP model in mice (n = 8,±SD, two-way ANOVA)(A, B) MWT and TWL of Sham and BCP group on 0, 7, 14 and 21 days after LLC cells implantation; (C) Bone histology of Sham group on day 21 after PBS administration (HE staining, 400×), bone trabecular (arrows); (D) Bone histology of BCP group on day 21 after LLC cells implantation (HE staining, 400×), infiltrated carcinoma cells (arrows).Scale bar = 100 μm***P < 0.001, compared with group Sham.

2.Nrf2 和HO-1 参与了BCP 的进展

Western Blot 结果显示，与BCP 组（0 天）对比，Nrf2 的表达在接种LLC 细胞后第7 天(P< 0.01)和14 天 (P< 0.05) 上调（见图2A, 2B），HO-1 的表达在接种LLC 细胞后第7 天 (P< 0.001) 和14 天 (P<0.05) 上调（见图2A, 2C）。免疫荧光染色结果显示，与BCP 组（0 天）对比，Nrf2 的表达在接种LLC细胞后第7 天 (P< 0.001)、14 天 (P< 0.001) 和21 天(P< 0.01) 上调（见图2D, 2F），HO-1 的表达在接种LLC 细胞后第7 天 (P< 0.001)、14 天 (P< 0.001)和21 天 (P< 0.05) 上调（见图2E, 2G）。这些结果表明，Nrf2 和HO-1 参与了BCP 的进展。

图2 BCP 小鼠脊髓Nrf2 和HO-1 的表达 (n = 4,±SD, one-way ANOVA)(A-C) Western Blot 检测Nrf2 和HO-1 的表达；(D, F) 免疫荧光染色检测Nrf2 的表达；(E, G) 免疫荧光染色检测HO-1 的表达*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与BCP 组（0 天）相比Fig.2 The expression of Nrf2 and HO-1 in the spinal cord of BCP mice (n = 4,±SD, one-way ANOVA)(A-C) Western Blot shows the expression of Nrf2 and HO-1; (D, F) Immunofluorescence staining shows the expression of Nrf2; (E, G) Immunofluorescence staining shows the expression of HO-1.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, compared with group BCP (0 d).

3.红景天苷减轻了BCP 小鼠的痛觉过敏

单次腹腔给药后0.5～1 h：与BCP 组对比，红景天苷组小鼠的MWT 增加（P< 0.01，见图3A）；与红景天苷组对比，红景天苷 + 葫芦巴碱组小鼠的MWT 降低（P< 0.01，见图3A）。单次腹腔给药后0.5～1.5 h：与BCP 组对比，红景天苷组小鼠的TWL 增加（P< 0.01，见图3B）；与红景天苷组对比，红景天苷 + 葫芦巴碱组小鼠的TWL降低（P< 0.05，见图3B）。连续腹腔给药后，与BCP 组对比，红景天苷组小鼠的MWT 和TWL 显著增加（P< 0.001，见图3C, 3D）；与红景天苷组对比，红景天苷 + 葫芦巴碱组小鼠的MWT 和TWL显著降低（P< 0.001，见图3C, 3D）。这些结果表明，红景天苷减轻了BCP 小鼠的痛觉过敏，葫芦巴碱逆转了红景天苷的镇痛作用。

图3 腹腔注射红景天苷和葫芦巴碱对BCP 小鼠行为学的影响 (n = 8,±SD, two-way ANOVA)(A, B) 小鼠单次注射红景天苷和葫芦巴碱后的MWT 和TWL；(C, D) 小鼠连续注射红景天苷和葫芦巴碱后的MWT 和TWL##P < 0.01，###P < 0.001，与BCP 组相比；△P < 0.05，△△P < 0.01，△△△P < 0.001，与红景天苷 + 葫芦巴碱组相比Fig.3 The effect of intraperitoneal administration of salidroside and trigonelline on behavior of BCP mice (n = 8,±SD, twoway ANOVA)(A, B) MWT and TWL of mice after single administration of salidroside and trigonelline; (C, D) MWT and TWL of mice after multiple administration of salidroside and trigonelline.##P < 0.01, ###P < 0.001, compared with group BCP; △P < 0.05, △△P < 0.01, △△△P < 0.001, compared with group Sal + Trig.

4.红景天苷上调了BCP 小鼠脊髓中Nrf2 和HO-1 的表达

Western Blot 结果显示，与Sham 组对比，BCP组小鼠脊髓中Nrf2 (P< 0.05) 和HO-1 (P< 0.01) 的表达明显上调（见图4A-C）；与BCP 组对比，红景天苷组小鼠脊髓中Nrf2 和HO-1 的表达进一步上调（P< 0.05，见图4A-C）；与红景天苷组对比，红景天苷+葫芦巴碱组小鼠脊髓中Nrf2 (P< 0.05)和HO-1 (P< 0.001) 的表达下调（见图4A-C）。免疫荧光染色结果显示，与Sham 组对比，BCP 组小鼠脊髓中Nrf2 (P< 0.001) 和HO-1 (P< 0.01) 的表达上调（见图4D-G）；与BCP 组对比，红景天苷组小鼠脊髓中Nrf2 (P< 0.05) 和HO-1 (P< 0.01) 的表达进一步上调（见图4D-G）；与红景天苷组比较，红景天苷 + 葫芦巴碱组小鼠脊髓中Nrf2 (P< 0.05)和HO-1 (P< 0.01) 的表达下调（见图2D-G）。这些结果表明，红景天苷上调了BCP 小鼠脊髓中Nrf2 和HO-1 的表达，葫芦巴碱逆转了红景天苷的这种作用。

图4 腹腔注射红景天苷对BCP 小鼠脊髓Nrf2 和HO-1 表达的影响 (n = 4,±SD, one-way ANOVA)(A-C) Western Blot 检测Nrf2 和HO-1 的表达；(D, F) 免疫荧光染色检测Nrf2 的表达；(E, G) 免疫荧光染色检测HO-1 的表达*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与Sham 组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，与BCP 组相比；△P < 0.05，△△P < 0.01，△△△P < 0.001，与红景天苷组相比Fig.4 The effect of intraperitoneal administration of salidroside on the expression of Nrf2 and HO-1 in the spinal cord of BCP mice (n = 4,±SD, one-way ANOVA)(A-C) Western Blot shows the expression of Nrf2 and HO-1; (D, F) Immunofluorescence staining shows the expression of Nrf2; (E, G) Immunofluorescence staining shows the expression of HO-1.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, compared with group Sham; #P < 0.05, ##P < 0.01, compared with group BCP; △P < 0.05,△△P < 0.01, △△△P < 0.001, compared with group Salidroside.

讨 论

BCP 模型是研究BCP 机制的基础[14]。本研究将LLC 细胞接种于小鼠股骨骨髓腔内建立BCP 模型，该模型可部分还原晚期BCP 病人的疼痛状态，以便于研究其病理生理状态及相关分子机制。痛行为学结果显示，BCP 组在接种LLC 细胞后第7～21天的MWT 和TWL 明显低于Sham 组，且疼痛程度随着时间进展呈现加重趋势。HE 染色结果显示，在接种LLC 细胞后第21 天，BCP 组小鼠股骨髓腔内的骨小梁结构被破坏，并被肿瘤细胞所侵袭，这与既往的研究结果一致[12]，表明BCP 模型的成功建立。

越来越多的研究发现，红景天苷有很强的镇痛作用；然而，目前尚未发现红景天苷应用于BCP的相关报道。由于BCP 的发病机制涉及炎性痛和神经病理性疼痛[2]；因此，本研究参考红景天苷在炎性痛和神经病理性疼痛模型中的使用剂量 (100 mg/kg)[6,15]；且我们的预实验结果显示，这一剂量的红景天苷对BCP 有良好的镇痛作用。此外，既往的研究发现，BCP 小鼠的痛行为学在模型建立后第14 天开始趋于稳定[13]。在本实验中，我们选择在接种LLC 细胞后第14 天开始对小鼠进行腹腔注射红景天苷。在对BCP 小鼠单次腹腔注射红景天苷后，该组小鼠的MWT 和TWL 相较于BCP 组明显增加，这种作用在腹腔注射后0.5 h 起效，1 h 达到峰值，并持续至2 h；连续腹腔注射红景天苷在一定程度上逆转了小鼠BCP 的进展。这些结果提示红景天苷对BCP 有可观的镇痛效应，为红景天苷减轻骨癌引起的痛觉过敏提供了直接证据。与红景天苷在既往研究中的用法不同[6,15]，单次腹腔注射红景天苷即可有效缓解小鼠BCP，其原因可能与给药方式的不同以及不同的动物模型对红景天苷的敏感性不同有关。

氧化应激在疼痛模型中发挥着重要作用[16,17]，Nrf2 的活化有助于减轻氧化应激从而缓解疼痛[18,19]。在本研究中发现，随着BCP 的进展，BCP 组小鼠脊髓中Nrf2 和HO-1 的表达逐渐下调，但BCP 组中Nrf2 和HO-1 的总体表达水平仍高于Sham 组；这与既往的实验结果一致[8,9,20]，提示小鼠脊髓中的Nrf2 和HO-1 参与了BCP 的发生发展。随着骨癌的进展，过度的氧化刺激会增加氧化水平，降低抗氧化水平，进而破坏氧化还原动态平衡。研究发现，高水平的氧化刺激会导致多巴胺神经元中的抗氧化酶失活[21]。糖尿病诱导的氧化应激破坏了Nrf2和p62 之间的前馈环路，直接导致抗氧化能力的下降，进一步加剧氧化损伤[9]。基于以上理论，我们推测骨癌可以导致氧化和抗氧化系统之间的失衡，但在BCP 的早期阶段（接种LLC 细胞后第7 天），骨癌诱导的氧化应激会刺激抗氧化能力的提升，从而上调Nrf2 和HO-1；在某种程度上，它提高了机体抵抗氧化应激的能力。然而，过度的氧化刺激导致氧化应激的稳态被破坏，这将促使BCP小鼠的抗氧化能力下降，最终抑制Nrf2 和HO-1 的表达，导致BCP 组小鼠脊髓中Nrf2 和HO-1 的表达在接种LLC 细胞后第14～21 天的下调。

红景天苷被证实在多种疾病中充当Nrf2 激活剂的角色[22,23]。此外，Nrf2 在疼痛模型中发挥关键作用，包括BCP[9]。腹腔注射奥替普拉可剂量依赖性地改善紫杉醇诱导的神经病理性疼痛[8]。鞘内注射萝卜硫素也可显著减轻大鼠BCP[9]。在本研究中发现，腹腔注射红景天苷可减轻BCP 小鼠的痛觉过敏。为了进一步明确Nrf2 是否参与腹腔注射红景天苷缓解小鼠BCP 的机制，葫芦巴碱 (20 mg/kg)被用于本实验，它是一种选择性Nrf2 拮抗剂，曾被用于阻断奥替普拉的Nrf2 激活作用[8]。痛行为学结果显示，相较于红景天苷组小鼠，红景天苷 +葫芦巴碱组小鼠的MWT 和TWL 明显下降，这提示葫芦巴碱逆转了红景天苷对于BCP 小鼠的镇痛作用。在紫杉醇诱导的神经病理性疼痛模型中，葫芦巴碱也逆转了奥替普拉的镇痛作用[8]。本研究的结果与其类似，这提示红景天苷对小鼠BCP 的镇痛效应涉及Nrf2 信号通路。更重要的是，腹腔注射红景天苷明显上调BCP 小鼠脊髓中的Nrf2 和HO-1，葫芦巴碱可逆转红景天苷的这一作用。萝卜硫素通过活化Nrf2/HO-1 通路发挥镇痛作用[24,25]；Nrf2/HO-1 通路介导硫化氢缓解神经病理性疼痛的机制[20]；此外，腹腔注射奥替普拉通过上调大鼠脊髓中的Nrf2 和HO-1 表达进而减轻痛觉过敏[8]。这些结果表明，腹腔注射红景天苷可以通过活化Nrf2/HO-1 通路缓解小鼠BCP。综上所述，本研究首次发现Nrf2/HO-1 通路的活化参与红景天苷缓解小鼠BCP 的机制，这为临床治疗BCP 提供了思路和理论依据。

然而本研究尚未明确红景天苷活化Nrf2/HO-1通路的具体机制；且Nrf2 的活化会促进下游多种抗氧化蛋白的表达，目前尚不明确小鼠BCP 中的Nrf2 活化后是否激活其余通路。这些需要进一步的研究。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。