无酒精番木瓜汁发酵饮料的制备工艺

张帆 黄瑶 凌明慧 苏佳骏 劳日毫 闭金栋

摘要：以番木瓜汁为原料制备番木瓜汁发酵饮料，研究无酒精发酵饮料的工艺条件。制备方法：先添加酵母菌，发酵2d，灭活酵母菌后，再添加醋酸菌和乳酸菌，继续发酵，酵母菌、醋酸菌、乳酸菌接种体积比为1：1：1。菌种生长曲线测定结果显示各菌株的最佳接种菌龄分别为：酵母菌为20 h（2.Oxl07 CFU／mL），醋酸菌为20 h（4.OxlOa CFU/mL），乳酸菌为12 h（I.OX108 CFU/mL）。正交实验结果表明：番木瓜汁发酵饮料的最佳发酵工艺为：初始SSC（可溶性固形物含量）为30%，接种量为g%，发酵周期为4d。发酵液经杀菌，置于4 0C冰箱中冷藏3d，澄清后，弃沉淀物，取上清液，所得产品不含酒精，pH值为3.53，SSC为14%，维生素C质量浓度为31.98 mg/（100 9），羟基自由基清除率为90.1%；色泽呈橙红色，具有番木瓜浓郁香气，口感酸甜协调。关键词：番木瓜；发酵饮料；接种菌龄；发酵工艺；感官评价中图分类号：TS275.4; Q939.99

DOI：10. 1637 5/j .cnki.cn4 5-139 5/t.2023.02.017

0引言

番木瓜（Carica papaya Linn．）又名木瓜，属番木瓜科、番木瓜属，多年生肉质草本植物，主产地在热带和亚热带地区，广泛栽培于中国福建、台湾、广东、广西、云南等省、自治区。番木瓜不仅可以作为水果鲜食，还可以用来加工果干、果汁、果酱和酶制剂等产品。番木瓜富含木瓜酵素（木瓜蛋白酶），具有良好的助消化作用，且含有丰富的糖类、多酚、番木瓜碱、有机酸等物质，具有抗氧化、降血糖及抑菌等多种功效[1-3]。

近年来，在实验室研究阶段，利用益生菌发酵生产果蔬酵素或发酵饮料的研究成果较多，但市场转化较少，还没有实现市场大量推广销售[4-5]。酵素生产一般周期较长，需要几个月时间，而发酵饮料生产周期较短，仅需数日。此外，发酵饮料营养丰富、口味独特、助消化，符合人体对健康、美味的需求，利于市场推广。在利用果蔬生产发酵饮料的研究中，绝大多数利用乳酸菌进行发酵[4-7]，少数利用酵母菌混合乳酸菌或醋酸菌进行发酵[8-10]。在木瓜品种方面，有研究利用光皮木瓜、野木瓜、番木瓜发酵生产酵素或乳酸菌饮料[11-13]，但利用酵母菌、醋酸菌、乳酸菌混合发酵生产番木瓜汁发酵饮料的研究尚未见报道。研究表明，使用多菌种混合发酵可以增加产品的风味和功能【5】，多菌种复合发酵产物可能比单菌种发酵产物能更好地促进健康[10】，但在利用酵母菌发酵果蔬饮料时，常常因为有酒味而受众不多。为解决以上问题，本研究以番木瓜汁为原料，用酵母菌、醋酸菌、乳酸菌进行发酵，采用先加入酵母菌发酵后灭活，再添加醋酸菌、乳酸菌的接种方法，以感官评分为指标进行最佳发酵条件的筛选，并进行感官评分和相关指标检测，得到的饮品香气浓郁，酸甜可口，营养丰富，为番木瓜的深加工和果蔬发酵饮料产品开发提供参考依据。

1材料和方法

1.1材料

番木瓜：市售；菌种：果酒酵母（安琪酵母股份有限公司）；醋酸菌（中科1.41号沪酿醋酸菌），购于沪酿曲种淘宝店；乳酸菌（植物乳杆菌），广西某大学微生物学实验室提供。

1.2培养基

醋酸菌培养基：葡萄糖10/-，酵母提取物1%，柠檬酸0. 1%，Na：HPO。-12H：0 0.5%，琼脂2%，pH 5.8[14]。

酵母菌PDA培养基：去皮马铃薯20%，葡萄糖10/-，琼脂1 .8%（配制液体培养基时则不加琼脂），121 0C灭菌20 min。

乳酸菌MRS培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母粉0.5%，葡萄糖2%，乙酸钠0.5%，柠檬酸氢二胺0.2%，吐温-80 0.1%，磷酸氢二钾0.2%，七水硫酸镁0.02%，七水硫酸锰0.005%，琼脂2%（配制液体培养基时则不加琼脂），pH值为6.2-6.4，121 0C灭菌20 min。

脱脂牛奶培养基‘”1：12g脱脂奶粉溶于100 mL蒸馏水中，115 0C灭菌20 min。

1.3方法

1.3.1 测定菌种生长曲线，确定接种菌龄

培养步骤：利用斜面培养基进行扩大培养（温度为30 0C，乳酸菌培养ld，醋酸菌和酵母菌培养2 d），用1 mL生理盐水洗脱1支菌种斜面，然后接种至100 mL液体培养基中培养（乳酸菌和酵母菌静置培养；醋酸菌以240 r/min的转速进行摇床培养）；酵母菌、醋酸菌培养44 h，每隔4h取样测定吸光度，乳酸菌培养30 h，每隔2h取样测定吸光度；制作菌种生长曲线，通过倾注培养法测菌数，确定接种菌龄。

测定方法：1）取1 mL菌液至离心管中，8 000r/min离心2 min。同时取样进行平板稀释倾注法测定菌数；2）弃去上清液，将沉淀在比色管中稀释至5 mL，以生理盐水为空白对照，测定OD，。。；3）根據吸光度制作酵母菌、乳酸菌和醋酸菌的生长曲线图，并对照菌数确定接种菌龄。

1.3.2发酵工艺流程

木瓜经清洗、去皮、去籽、切块、榨汁、过滤、调糖、煮沸杀菌、冷却、接种、发酵、巴氏消毒、冷藏、澄清、去沉淀后获得产品。

工艺要点：

1）木瓜汁的制备：称取定量的成熟、无发霉、无变质的番木瓜，去皮、去籽后榨汁，用专用过滤纱网进行过滤后备用。

2）调糖：将木瓜汁按照体积比I：I加水，分装于无菌瓶内，再将白砂糖加入木瓜汁中，混匀后通过手持糖度仪对其SSC（可溶性固形物含量）进行测定，将其初始SSC调整至设定值。

3）杀菌：隔水煮沸5 min后冷却。

4）接种发酵：将酵母菌、醋酸菌、乳酸菌菌种分别转接到液体培养基中，培养至相应接种菌龄。先接种酵母菌，2d后隔水煮沸5 min来灭活酵母菌，冷却后再接入醋酸菌和乳酸菌。发酵温度为30 0C，3种菌按体积比l：I：I接种。

5）巴氏消毒：将发酵瓶装产品放入85。C热水中保温10 min。

6）冷藏、澄清去沉淀：将消毒冷却后的发酵瓶装产品放入4 0C冰箱中冷藏3d，澄清后，弃沉淀物，取上清液，即得产品。1.3.3单因素试验

初始SSC梯度分别设定为18%、22%、26%、30%、34%；发酵时间梯度分别设定为3d、4d、Sd、6d、7 d；接种量（3种菌总的接入量）梯度分别设定为2%、4%、6%、g%、12%。发酵结束测定pH值和SSC值，进行感官评分。1.3.4正交试验

根据单因素结果，以发酵时间（A）、初始SSC（B）、接种量（C）为考察因素，以感官评分为评价指标，设计L。（33）正交试验，确定最佳发酵工艺条件。因素水平表见表1。1.3.5验证试验

根据正交试验所得的最佳发酵条件结果进行验证试验。进行感官评分，测定产品的SSC、pH、维生素C含量、抗氧化活性，验证最优发酵工艺参数的可靠性。1.3.6检测方法

维生素C含量的测定采用二氯靛酚法‘“1。pH值的测定采用酸度计法。酒精度参照国标测定，SSC的测定采用手持糖度仪法。抗氧化活性的测定采用邻二氮菲_Fe2+氧化法，测定羟基自由基清除率。

1.3.7感官评定

评分方法如表2所示。感官评定标准如表3所示。

2结果和讨论

2.1 生长曲线的测定及确定接种菌龄

从图1可见，酵母菌生长曲线的延滞期不明显，6-24 h是指数期，生长速度较快，繁殖速率增加，酶系活跃，代谢旺盛，适合用来接种，培养到20 h对应的吸光度值为0.907，菌数达到2.Ox107 CFU/mL，符合接种所需菌数要求，因此选择20h作为接种菌龄。培养24 h后进入稳定期。

乳酸菌在2-4 h为延滞期，时间较短，4-16 h则为指数期，培养到12 h所对应的吸光度值为0.824，菌数测定结果为I.OxlOs CFU/mL，达到接种所需菌数要求，因此选择12 h作为接种菌龄。16 h后菌种则进入稳定期。

醋酸菌的生长曲线延滞期不明显，0-36 h为指数期，取指数期菌液进行平板菌数测定，20h对应的吸光度值为0.408，菌数为4.OxlOs CFU/mL，达到接种所需菌数要求，因此选择20 h作为接种菌龄，36h以后进入稳定期。

2.2发酵条件的筛选结果

2.2.1初始SSC

设置不同初始SSC梯度，接种量10%，发酵6d，每2d测定产品pH值、残余SSC，6d后进行感官评分，pH值和SSC变化曲线图如图2和图3所示，6d后感官评分结果如图4所示，

由图2可见，添加酵母菌发酵2d时，各梯度发酵液pH值相差不大，处于4.62-4.78之间。添加乳酸菌和醋酸菌发酵4d和6d后，糖分被菌种利用，进而发酵产酸，初始SSC越大的产品pH值越低，可见菌种可利用的糖分越多，产酸越多。6d后各梯度发酵液pH值降至4.24-4.40。乳酸菌、醋酸菌发酵时产生大量的乳酸、乙酸，还产生少量甲酸、丙酸等其他酸性末端产物，这些代谢产物可使pH值下降，起到抑制有害微生物的作用。发酵产生的代谢物如酸类、醇类和酯类及残余的糖分共同影响了产品的口感和风味。

由图3可见，SSC中的糖类等可发酵物质被菌种利用，经2d、4d、6d后均逐渐减少。发酵6d后的感官评分图见图4，初始SSC为18%-22%时，气味较酸，稍刺鼻，口感较酸，稍苦涩，色泽稍暗淡，有沉淀，感官评分60分以下；初始SSC为26%时，有番木瓜气味，口感较甜，稍酸，色泽均匀，有沉淀，感官评分为70分；初始SSC为30%～34%时，气味香甜，有番木瓜典型气味，口感甜，稍酸，色泽均匀，有沉淀，感官评分为85分以上。考虑到添加糖分过多会造成口感过甜，从人体健康和成本方面考虑，选择评分较高的初始SSC为26%、30%，34%进行正交试验。

2.2.2发酵时间

设置初始SSC为30%，接种量为10%，发酵不同天数后，测定产品pH值、SSC，并进行感官评分，结果见图5和图6。

番木瓜汁接种酵母发酵2d后，经85 0C烫煮杀菌，接入醋酸菌和乳酸菌继续发酵。如图5所示，随着发酵时间的延长，产品pH值逐渐下降。发酵3d后的pH值为4.43，发酵4d后为4.25，在发酵7d后降至4.15。如图6所示，发酵时间越长，糖分被转化，残余SSC呈下降趋势，发酵4d时为21%，7d后降至12%。酵母菌含有麦芽糖酶、蔗糖酶、转化酶、乳糖分解酶及脂肪酶等，在这一系列酶的作用下，将原料中的糖分转化。将酵母菌杀灭后，接种乳酸菌和醋酸菌，醋酸菌有很强的醇脱氢酶、醛脱氢酶等氧化酶系活力，除能氧化酒精生成醋酸外，还有氧化其他醇类和糖类的能力，生成相应的酸、酮等物质，与乳酸菌共同作用形成产品的风味物质。感官评定结果为，发酵3d的产品色泽均一，香气较浓郁，口感过甜，微酸，有沉淀；发酵4d的产品色泽均一，香气纯正浓郁，口感酸甜协调，有沉淀，得分为87分；发酵5d、6d的产品色泽均一，气味较为协调，口感微甜，较酸，有沉淀，得分为80分、76分；发酵7d的产品色泽均一，气味稍刺鼻，口感不甜，较酸，有沉淀，质量欠佳的原因可能是发酵时间过长，糖度过低，菌种后期产生的代谢物质和死亡自溶产生的物质影响产品质量。因此选择发酵时间为4d、Sd、6d进行正交试验。

2.2.3接种量

番木瓜汁初始SSC为30%，测得初始pH值为4.07。设置不同的接种量，每2d測定产品pH值、残余SSC，发酵4d后进行感官评分，结果见图7-图9。

不同接种量的pH值变化情况如图7所示，随着发酵时间延长，pH值下降。不同接种量对pH值影响不明显，接种量增加，pH值稍有上升。发酵4d各梯度发酵液pH值为3.83-3.94。说明菌种在一定时间内完成增殖后，均能够发酵产酸使产品pH值降低，接种量小，增殖达到相应的数量虽然慢一些，但不影响最终产酸量，可能在酸性物质的种类上有差别。

不同接种量的SSC变化情况如图8所示，接种量对残余SSC影响较大，随着接种量增加，残余SSC呈下降趋势，发酵4d时，接种量为2%的产品，其SSC为26%，接种量为12%的产品，其SSC为21%。

图9所示为感官评分结果，随着接种量的增加，感官评分分值逐渐上升。接种量为9%～12%的产品的感官评分都达到了87分，色泽呈橙黄色，气味较为浓郁，口感酸甜适中，有沉淀。因此选择接种量为6%、g%、12%进行正交试验。

2.2.4正交试验

正交试验结果和极差分析结果分别如表4、表5所示。

从表4、表5可知，以感官评分为指标，3个因素影响的主次是A>C>B，即发酵时间>接种量>初始SSC；试验最优组合为AIB2C2，即初始SSC为30%、发酵时间为4d、接种量为g%，此时其感官评分得分最高。

2.2.5验证试验

根据正交试验所得的最佳发酵条件进行验证试验，分别在发酵0、2d、4d时测定各项指标，见表6。

番木瓜汁发酵4d所得酵素产品色泽呈橙红色，纯正均一，具有番木瓜的典型浓郁香气和发酵饮料酸甜可口的特征，感官评分为88分。经测定产品酒精度为0、pH值为3.53、SSC为14%、维生素C质量浓度为31.98 mg/（100 9），羟基自由基清除率为90.1%。羟基自由基是一种极具攻击性的活性氧，与机体多种疾病的发生密切相关。本研究所得番木瓜汁发酵饮料的羟基自由基清除率数值和文献[8]所得酵素相近，具有一定的抗氧化能力，原因是产品保留了原料的维生素C成分，富含酚类物质，且酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等在发酵过程中会产生抗氧化性物质[10]。

3结论

本研究以番木瓜汁为原材料，先将酵母菌接种，发酵2d，烫杀后添加乳酸菌和醋酸菌，再发酵2d，发酵液经杀菌，放置于4 0C冰箱中冷藏3d，澄清后，弃沉淀物，取上清液，得到一种不含酒精、酸甜可口的番木瓜汁发酵饮料。番木瓜汁发酵饮料为橙红色，颜色明艳，富含维生素C，具有一定的抗氧化能力，符合时尚健康饮品的需求趋势，其富含酶类，香气浓郁，可以助消化，清新口气，值得进一步研发和推广。

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Preparation technology of non-alcoholic fermented beverage of

papaya juice

ZHANG Fan"2， HUANG Yao*"2， LING Minghui"2， SU Jiajun"2， LAO Rihao"2， BI Jindong"2

（ I .  School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou   545006， China; 2. Guangxi Liuzhou River Snail Rice Noodles Engineering Technology Research Center

（ Guangxi University of Science and Technology）  ， Liuzhou 545006， China）

Abstract： The C.arica papaya Linn. used as the raw material， the technological conditions of non-   alcoholic fermented beverage were studied. The non-alcoholic fermented beverage was produced by   adding yeast for 2 d fermentation and inactivating yeast， adding acetic acid bacteria and lactic acid  bacteria. And the inoculation volume ratio of yeast， acetic acid bacteria and lactic acid bacteria was   I ： I ： 1 The growth curves of three strains were studied， the optimum inoculation age were yeast 20 h   （2.Ox107 CFU/mL）， acetic acid bacteria 20 h （4.Ox108 CFU/mL） and lactic acid bacteria 12 h （ l.Ox

108 CFU/mL） . The best fermentation process of papaya juice fermented beverage by orthogonal test

is as follows： The initial SSC（soluble solid content ）was 30%， the inoculation amount was g%， and the  fermentation period was 4 d. The fermentation broth was sterilized and refrigerated at 4 0C for 3 d   clarification. then the precipitation was discarded and the supernatant was taken. The product contained   no alcohol， pH 3.53， SSC 14%， vitamin C content 31.98 mg/（100 g）， hydroxyl radical clearance rate   90. 1%. It is orange red in color， with a strong aroma of C. arica papaya Linn. and a sweet and sour taste.

Key words： C.arica papaya Linn.; fermented beverage; inoculation age; fermentation process; sensory   evaluation