补中益气汤加减升麻、柴胡对脾虚泄泻大鼠胃肠、免疫功能及肠黏膜屏障的影响差异

葛文静，单朋涛，2，李兵杰，2，王慧森，刘明，李华妮，李更生，梁瑞峰，2 [. 河南省中医药研究院（河南省中西医结合医院），河南 郑州 450004；2.河南中医药大学，河南 郑州 450046]

中医理论认为，在方剂配伍中通过运用引经药可改变其他药物的作用方向，使其作用侧重或集中于特定的部位，引导药物直达经络脏腑，使药效靶向集中。引经药的使用，是中医遣方用药的一大特色，极大地丰富了方剂配伍的内容。现代研究[1-2]表明，引经药可增强中药疗效，若引经药使用得当，能起到事半功倍的作用，对临床用药具有重要意义。

补中益气汤出自李东垣的《脾胃论》，为治疗脾胃气虚的经典方剂，方中升麻、柴胡升阳举陷，升麻引阳明清气上升，柴胡引少阳清气上升，在方中发挥脾经引经作用。中医认为脾主运化，司中气，与胃同为气血生化之源，脾胃虚弱，运化失司，可因水谷精微吸收不足，以致气血生化之源匮乏。临床和基础研究均显示，脾虚患者消化功能紊乱，免疫功能低下[3-4]。因此，本研究拟通过脾虚泄泻大鼠模型，观察补中益气汤加减引经药升麻、柴胡后，对脾虚泄泻大鼠胃肠功能、免疫紊乱和肠黏膜的影响，以期阐明升麻、柴胡的引经增效作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SD 大鼠，雄性，SPF 级，6～8 周，体质量（200 ± 20）g，济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，生产许可证号：SCXK（鲁）2019-0003，动物质量合格证号：0002478。饲养于河南省中医药研究院SPF 级实验动物中心，饲养温度：20～22 ℃，湿度：45%～55%，12 h 光暗循环周期。实验经河南省中医药研究院实验动物伦理委员会批准，批准号：HNTCMDW-20200306。

1.2 药物及试剂 黄芪、炙甘草、人参、当归、陈皮、白术、升麻、柴胡购于河南省顺康医药有限公司，经河南省中医药研究院王慧森副研究员鉴定，均符合2020 年版《中华人民共和国药典》项下规定；利血平注射液，天津金耀药业有限公司，批号：1903211；异氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司，批号：R510-22；胃泌素（gastrin，GAS）试剂盒，武汉华美生物公司，批号：Y13035081；大鼠白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）、血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）ELISA 试剂盒，武汉伊莱瑞特生物公司， 批号分别为： GY02VFJN5336、ERSH5RSLJC、V26VVA4LFA；CD3+、CD4+、CD8+一抗，美国Biolegend 公司，批号分别为：B247807、B201139、B263802；p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、磷酸化p38 丝裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38 MAPK）一抗，武汉三鹰公司，批号分别为：14064-1-AP、28796-1-AP；闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、闭合蛋白（Occludin）一抗，美国Affinity 公司，批号分别为：44h7470、53t8241。

1.3 仪器 2K15 型冷冻离心机，德国Sigma 公司；Synergy NEO 型全功能酶标仪，美国Bio-Tek 公司；IX73 型显微镜，日本Olympus 公司；Fluorchem R 型成像系统，美国Alpha Innotech 公司；NAVIOS 流式细胞仪，美国Beckman Coulter 公司；R500 型小动物麻醉机，深圳瑞沃德生命科技有限公司；DYCZ-24DN 型电泳仪、DYCZ-40D 型电泳仪，北京六一生物科技有限公司。

1.4 药物制备 大黄提取液[5]：称取大黄500 g，取10 倍量70%乙醇，加热回流提取2 次，每次2 h，合并滤液，减压回收乙醇，调整浓度为相当于含生药1.5 g·mL-1。补中益气汤提取液：按原方比例称取适量药材加10 倍量水，浸泡30 min 后煎煮2 h，提取2 次，合并滤液，调整浓度为含生药1.323 g·mL-1。补中益气汤缺升麻、柴胡组提取液制备方法同上，调整质量浓度为补中益气汤缺升麻组（含生药1.197 g·mL-1）、补中益气汤缺柴胡组（含生药1.197 g·mL-1）和补中益气汤缺升麻柴胡组（含生药1.071 g·mL-1），4 ℃冰箱保存备用。

1.5 模型复制及给药 雄性SD 大鼠随机分为正常组、模型组、补中益气汤全方组（含生药13.23 g·kg-1）、补中益气汤缺升麻组（含生药11.97 g·kg-1）、补中益气汤缺柴胡组（含生药11.97 g·kg-1）和补中益气汤缺升麻柴胡组（含生药10.71 g·kg-1），每组10 只。采用“利血平+大黄+隔日进食”多因素法复制脾虚泄泻大鼠模型[6]，方法如下：大鼠灌胃大黄提取液（15 g·kg-1），每日1 次；皮下注射利血平（0.5 mg·kg-1），隔日1 次；隔日禁食，与利血平交替进行。正常大鼠每日灌胃蒸馏水、皮下注射等体积生理盐水，共14 d。大鼠出现精神萎靡、摄食量减少、毛发枯黄、眯眼懒动、扎堆弓背、大便稀溏、肛周污秽、体质量降低等症状，提示模型复制成功。从第3 周开始，每日上午灌胃给药，下午给予大黄提取液（15 g·kg-1），每日1 次，连续14 d，正常组和模型组的大鼠灌服等体积蒸馏水。

1.6 一般状态观察及腹泻指数的测定 观察各组大鼠的精神状态、活跃程度、皮肤毛发、饮食状态、大便状态等变化。给药前、末次给药后将各组的每只大鼠分别置于代谢笼中，笼下放置滤纸，统计4 h 内滤纸上所有粪便总数、稀便数，计算各组大鼠腹泻指数[6]。稀便率：稀便次数与总便次数之比。稀便级：以稀便污迹的直径进行定级，分为4 级：1 级（＜1 cm）、2 级（1～2 cm）、3 级（2～3 cm）、4 级（＞3 cm）。逐一统计每堆稀便的级数，然后将该鼠所有稀便级数相加后除以稀便次数，得到平均稀便级。计算腹泻指数：腹泻指数=稀便率×平均稀便级。

1.7 脾脏及胸腺指数 末次给药后禁食不禁水24 h，2.5%异氟烷1 L·min-1吸入麻醉，腹主动脉取血，900×g离心10 min 分离血清，-80 ℃保存。取一部分空肠置于4%多聚甲醛固定，另一部分-80 ℃保存。分离各组大鼠的脾脏和胸腺，去除附带脂肪组织，用滤纸吸干水分后称质量，计算脾脏及胸腺指数。脾脏指数=脾脏质量（mg）/体质量（g），胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g）。

1.8 空肠组织病理学的观察 空肠组织经4%多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，切片，HE 染色后于显微镜下观察各组大鼠空肠组织的病理学改变。

1.9 血清IL-6、IL-10、GAS、VIP 的测定 麻醉后腹主动脉取血，900×g离心10 min，分离血清，-80 ℃保存备用。血清中IL-6、IL-10、GAS、VIP 均用ELISA 试剂盒测定，按试剂盒说明书进行操作。

1.10 血液中T 淋巴细胞亚群的测定 取3 mL 血于抗凝管中，按流式抗体说明书进行处理，采用流式细胞仪进行T 淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+亚群的检测，计数CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴细胞的百分比和CD4+/CD8+T 淋巴细胞的比值。

1.11 空肠组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白的表达 取适量空肠组织，加入RIPA裂解液冰上裂解提取组织蛋白。BCA 法检测蛋白浓度，100 ℃变性5 min 后取等量蛋白经聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，然后将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，弃封闭液后漂洗3 次，分别加入p38 MAPK（1∶1 000）、p-p38 MAPK（1∶2 000）、ZO-1（1∶2 000）、Occludin（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）一抗4 ℃孵育过夜，羊抗鼠二抗（1∶10 000）室温下震荡孵育1 h，洗膜后加入ECL 显色液曝光拍照，ImageJ 软件分析灰度值，以目的条带/GAPDH 灰度值计算蛋白相对表达量。

1.12 统计学处理方法 采用SPSS 26.0 软件对结果进行统计分析，数据以均数± 标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠一般状态的影响 正常组大鼠活动情况及精神状态良好，毛发白亮有光泽，摄食量正常，大便椭圆颗粒状，无腹泻。模型组大鼠精神萎靡、眯眼拱背、扎堆蜷缩、摄食量及活动减少、毛发枯黄、大便稀溏，肛周污秽。不同配伍补中益气汤药物组大鼠较模型组大鼠精神状态均有改善，毛发有光泽，摄食量增加，大便基本成形。

2.2 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠腹泻指数的影响 结果见表1。正常组大鼠给药前后均无腹泻。给药前，模型组与补中益气汤各药物组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。给药后，与模型组比较，补中益气汤全方组和补中益气汤缺柴胡组大鼠腹泻指数均不同程度降低（P＜0.01，P＜0.05）。与补中益气汤全方组比较，补中益气汤缺升麻柴胡组大鼠腹泻指数增高，差异有统计学意义（P＜0.05），说明其疗效不如补中益气汤全方组。

表1 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠腹泻指数的影响（±s，n=10）Table 1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian- guiding drug on diarrhea index in splenasthenic diarrhea rats（± s，n=10）

表1 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠腹泻指数的影响（±s，n=10）Table 1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian- guiding drug on diarrhea index in splenasthenic diarrhea rats（± s，n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与补中益气汤全方组比较，△P＜0.05

给药后0 1.02±0.19**0.72±0.13##0.86±0.23 0.83±0.16#0.92±0.18△组别正常组模型组补中益气汤全方组补中益气汤缺升麻组补中益气汤缺柴胡组补中益气汤缺升麻柴胡组剂量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71给药前0 1.03±0.20**1.02±0.17 1.00±0.18 0.99±0.22 1.02±0.23

2.3 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠脾脏指数及胸腺指数的影响 结果见表2。与正常组比较，模型组大鼠脾脏指数、胸腺指数明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，不同配伍补中益气汤药物组大鼠脾脏指数、胸腺指数明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。与补中益气汤全方组比较，补中益气汤缺升麻、补中益气汤缺柴胡、补中益气汤缺升麻柴胡组大鼠脾脏指数、胸腺指数均不同程度降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）

表2 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠脾脏指数及胸腺指数的影响（±s，n=10）Table 2 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on spleen index and thymus index in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

表2 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠脾脏指数及胸腺指数的影响（±s，n=10）Table 2 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on spleen index and thymus index in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

胸腺指数/（mg·g-1）1.56±0.15 1.22±0.15**1.52±0.11##1.42±0.22#1.45±0.21#1.40±0.26#组别正常组模型组补中益气汤全方组补中益气汤缺升麻组补中益气汤缺柴胡组补中益气汤缺升麻柴胡组剂量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71脾脏指数/（mg·g-1）2.62±0.28 2.22±0.21**2.60±0.21##2.54±0.17##2.52±0.20##2.45±0.24#

2.4 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠空肠组织病理形态的影响 结果见图1。HE 染色结果显示，正常组大鼠空肠黏膜结构清晰、完整，绒毛形态规则，固有层未见炎性细胞浸润。脾虚泄泻模型组大鼠空肠绒毛变形、弯曲、萎缩，空肠黏膜损伤明显，部分上皮细胞缺失，固有层可见大量炎症细胞浸润，腺体排列紊乱。不同配伍补中益气汤药物组大鼠空肠黏膜损伤较模型组可见不同程度改善，炎症细胞浸润减少，腺体排列较整齐。与缺升麻、柴胡的各组比较，补中益气汤全方组改善更为明显。

图1 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠空肠组织病理形态的影响（HE 染色，×200）Figure 1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on the pathological morphology of jejunum tissue in splenasthenic diarrhea rats（HE staining，×200）

2.5 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠血清中IL-6、IL-10、GAS、VIP 水平的影响 结果见表3。模型组大鼠血清中IL-6 水平较正常组明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，不同配伍补中益气汤组血清中IL-6 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），但补中益气汤全方组降低更明显（P＜0.05，P＜0.01）。与正常组比较，模型组大鼠血清中IL-10、GAS、VIP 水平均明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，补中益气汤全方组大鼠血清中IL-10、GAS、VIP 水平均不同程度升高（P＜0.01）。与补中益气汤全方组比较，补中益气汤缺升麻组、补中益气汤缺柴胡组、补中益气汤缺升麻柴胡组大鼠血清中GAS、VIP 的水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），说明补中益气汤全方组疗效更佳。

表3 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠血清中IL-6、IL-10、GAS 和VIP 水平的影响（±s，n=10）Table 3 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on serum IL-6 ，IL-10，GAS and VIP levels in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

表3 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠血清中IL-6、IL-10、GAS 和VIP 水平的影响（±s，n=10）Table 3 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on serum IL-6 ，IL-10，GAS and VIP levels in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与补中益气汤全方组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

VIP/（pg·mL-1）198.23±29.60 130.67±15.02**187.11±27.61##154.84±20.70#△△165.95±15.23##△144.84±16.49△△组别正常组模型组补中益气汤全方组补中益气汤缺升麻组补中益气汤缺柴胡组补中益气汤缺升麻柴胡组剂量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71 IL-6/（pg·mL-1）35.13±4.34 52.45±6.10**37.43±4.19##42.60±4.81##△40.61±4.35##46.88±5.85#△△IL-10/（pg·mL-1）28.58±4.70 21.01±3.43**27.48±4.45##24.34±3.29 24.51±2.77#23.40±3.52△GAS/（ng·mL-1）2.53±0.35 0.98±0.15**1.56±0.24##1.32±0.22##△1.13±0.22△△1.02±0.19△△

2.6 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠血液中T淋巴细胞亚群的影响 结果见图2、表4。T 淋巴细胞亚群流式结果显示，与正常组比较，模型组大鼠外周血中CD3+、CD4+T 淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值降低（P＜0.01）。与模型组比较，补中益气汤全方组大鼠外周血中CD3+、CD4+T 淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值均有所升高（P＜0.01），且较补中益气汤缺升麻柴胡组升高更明显（P＜0.05，P＜0.01）。与正常组比较，各组大鼠外周血CD8+T 淋巴细胞百分比的差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠血液中T 淋巴细胞亚群影响的流式细胞仪检测结果Figure 2 Results of flow cytometry of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on T lymphocyte subsets in blood of splenasthenic diarrhea rats

表4 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠血液中T 淋巴细胞亚群的影响（±s，n=10）Table 4 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on T lymphocyte subsets in blood of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

表4 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠血液中T 淋巴细胞亚群的影响（±s，n=10）Table 4 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on T lymphocyte subsets in blood of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与补中益气汤全方组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

CD4+/CD8+2.71±0.54 1.88±0.28**2.46±0.41##2.04±0.22△2.23±0.43#2.08±0.34△组别正常组模型组补中益气汤全方组补中益气汤缺升麻组补中益气汤缺柴胡组补中益气汤缺升麻柴胡组剂量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71 CD3+/%56.14±4.30 39.46±6.55**53.42±4.36##51.91±5.07##47.45±5.31##△44.34±5.93#△△CD4+/%41.03±4.29 25.75±4.15**38.01±2.91##34.95±3.93##32.62±2.58##△△29.82±3.23#△△CD8+/%15.50±2.45 13.89±2.92 15.73±2.52 17.28±1.89##15.16±3.34 14.71±3.07

2.7 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠空肠组织p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白表达的影响 结果见图3、表5。与正常组比较，模型组大鼠空肠中p-p38 MAPK 蛋白表达水平升高（P＜0.01），ZO-1、Occludin 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，补中益气汤全方组大鼠空肠中p-p38 MAPK 蛋白水平降低， ZO-1、Occludin 蛋白表达水平增加（P＜0.01）。与补中益气汤全方组比较，补中益气汤缺升麻柴胡组大鼠空肠中p-p38 MAPK 蛋白表达水平升高，ZO-1、Occludin蛋白水平降低（P＜0.01）。

图3 各组大鼠空肠组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白的表达Figure 3 The protein expressions of p38 MAPK，p-p38 MAPK，ZO-1 and Occludin in jejunum tissue of rats of each group

表5 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠空肠组织p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白表达的影响（±s，n=6）Table 5 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on the protein expressions of p38 MAPK，p-p38 MAPK，ZO-1 and Occludin in jejunum tissue of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=6）

表5 补中益气汤加减引经药对脾虚泄泻大鼠空肠组织p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白表达的影响（±s，n=6）Table 5 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on the protein expressions of p38 MAPK，p-p38 MAPK，ZO-1 and Occludin in jejunum tissue of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=6）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与补中益气汤全方组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

Occludin 0.74±0.12 0.37±0.06**0.70±0.10##0.49±0.05#△△0.64±0.09##0.41±0.07△△组别正常组模型组补中益气汤全方组补中益气汤缺升麻组补中益气汤缺柴胡组补中益气汤缺升麻柴胡组剂量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71 p38 MAPK 0.56±0.06 0.56±0.04 0.58±0.06 0.53±0.06 0.57±0.07 0.57±0.07 p-p38 MAPK 0.23±0.03 0.44±0.06**0.28±0.03##0.35±0.05##△0.33±0.04##0.39±0.04#△△ZO-1 0.66±0.10 0.34±0.04**0.56±0.06##0.42±0.05#△△0.39±0.04△△0.45±0.05##△△

3 讨论

中医理论认为，在方剂配伍中运用引经药可引导药物直达经络脏腑，使药效靶向集中，从而提高疗效[7]。补中益气汤是治疗脾胃气虚的代表方，方中升麻、柴胡升阳举陷，协助君药升提下陷之中气，《本草纲目》：“升麻引阳明清气上升，柴胡引少阳清气上行，此乃禀赋虚弱，元气虚馁，及劳役饥饱，生冷内伤，脾胃引经最要药也”，在方中共为引经佐使药。中医认为脾主运化，脾胃虚弱、脾失健运可导致腹胀、泄泻等肠道功能紊乱症状。本研究采用“大黄+利血平+隔日进食”多因素法复制脾虚泄泻大鼠模型，模型大鼠出现大便溏稀、精神萎靡、眯眼拱背、扎堆蜷缩等与临床脾虚证相似的症状，且模型大鼠脾脏指数、胸腺指数及血清IL-6、IL-10、GAS、VIP 等指标均与正常大鼠有明显性差异，表明脾虚泄泻大鼠模型复制成功。不同配伍的补中益气汤均可改善脾虚泄泻大鼠的症状，以补中益气汤全方组效果最为明显，补中益气汤缺柴胡组次之，表明升麻、柴胡对补中益气汤具有引经增效作用，且升麻的引经增效作用优于柴胡。

中医认为脾主运化，其功能主要与胃肠运动、胃肠激素分泌等密切相关，脾胃虚弱可导致机体消化功能紊乱[8]。GAS 作为调节胃肠运动的激素，具有调节吸收、转运及代谢等生理活性，可加强胃肠运动和胆囊收缩，促进胃蛋白酶原、胃酸、胆汁的分泌，是衡量胃肠功能的重要指标[9-10]。VIP 是由肠道神经元分泌的调节中枢神经与胃肠运动的一种主要的抑制性神经递质，可通过松弛胃肠平滑肌，抑制结肠和直肠紧张性及小肠运动。VIP 水平异常可致胃肠动力和分泌功能紊乱，导致肠道平滑肌运动障碍，引起腹泻[11-12]。有研究[13]表明，多因素诱导的脾虚大鼠模型在造模第2 周时血浆中VIP 水平较正常大鼠增高，第3 周后VIP 水平较正常大鼠降低，而GAS 水平在整个造模期间均低于正常大鼠。在造模的不同时间点各种胃肠激素水平会发生不同的变化，导致胃肠运动无节律、消化液分泌紊乱，严重影响到胃肠的消化吸收功能，引起胃肠功能紊乱。本研究结果显示，模型组大鼠腹泻指数高于正常组，血清GAS、VIP 水平均明显低于正常组，补中益气汤各给药组大鼠腹泻指数降低，GAS、VIP 水平均有不同程度升高，胃肠功能紊乱有所改善，其中补中益气汤全方组疗效更明显，提示升麻、柴胡作为引经药可能通过调控胃肠激素的分泌调节胃肠功能而发挥增效作用。

脾与免疫系统密切相关，中医认为脾居中焦，为气血生化之源，气机升降之枢纽，是人体抗御病邪的重要防卫机构[8]。胸腺是T 细胞分化、成熟的器官，脾脏是成熟T 细胞等定居和产生免疫应答的场所，二者是机体最重要的免疫器官。脾脏及胸腺指数的改变可直观反映机体及细胞免疫水平的变化[14-15]。T 淋巴细胞亚群是监测机体细胞免疫功能的重要指标，CD3+T 细胞是体内的T 淋巴细胞总和，存在于外周血T 淋巴细胞和胸腺细胞表面，参与机体抗原应激反应。CD4+T 淋巴细胞主要发挥免疫调节作用，可抑制免疫细胞的活化。CD8+T 细胞主要是一类具有杀伤活性的效应细胞，能直接识别靶细胞，发挥免疫效应。CD4+与CD8+T 淋巴细胞，两者相互协作共同发生作用，CD4+/CD8+比值变化比较敏感，可及时反映机体当前的免疫状态[16-18]。IL-6 作为机体炎症反应最早出现的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞、淋巴细胞产生，在肠道炎症中，IL-6 的过度表达会影响肠上皮细胞的电解质分泌，使肠黏膜通透性增加，IL-10 主要由CD4+Th2 辅助细胞亚群产生，是细胞免疫反应的抑炎症因子[19-20]。本研究发现，脾虚泄泻大鼠血清中CD3+T 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值较正常组明显下降，IL-6 水平升高，IL-10 含量降低，表明脾虚可使机体免疫功能降低；不同配伍补中益气汤可提高脾虚泄泻小鼠脾脏及胸腺指数，提高CD3+T 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞百分比，恢复T 淋巴细胞CD4+/CD8+的平衡，降低IL-6 水平，升高IL-10 含量，补中益气汤全方组改善更明显，提示升麻、柴胡对补中益气汤提高免疫功能有引经增效作用。

脾虚泄泻可引起炎症反应，造成肠黏膜屏障破坏，进而导致腹泻的发生。研究[21-22]表明，肠道细胞间的紧密连接是构成肠道屏障的重要组成部分，是调节肠黏膜通透性的关键因素。ZO-1、Occludin 蛋白作为紧密连接的重要组成蛋白，对维持肠黏膜屏障结构完整、功能正常及调节肠道通透性发挥着重要作用。ZO-1 还作为桥梁蛋白，可将Occludin 蛋白的末端与细胞骨架蛋白连接起来，维持紧密连接结构稳定[23-24]。研究[25]表明，ZO-1 蛋白表达减少，将导致其他紧密连接蛋白的表达下调，使得紧密连接结构完整性遭到破坏，肠黏膜屏障功能破坏。Occludin蛋白的缺乏，会导致肠黏膜屏障功能障碍，使肠道通透性增加，引起腹泻[26]。p38 MAPK 是MAPK 家族成员之一，可以介导应激、炎症等细胞反应。p38 MAPK 磷酸化为p-p38 MAPK 后激活，可调控下游转录因子，促进IL-6、TNF-α 等细胞因子的分泌，引起肠黏膜炎症反应。同时，p38 MAPK 信号通路激活可抑制ZO-1、Occludin 等蛋白的表达，导致肠道紧密连接结构破坏[27-29]。本研究结果显示：脾虚泄泻模型组大鼠空肠组织病理学观察可见绒毛弯曲、变形、萎缩，空肠黏膜损伤，部分上皮缺失，固有层可见大量炎症细胞浸润，组织内p-p38 MAPK 蛋白表达增加，ZO-1 和Occludin 蛋白表达减少；与模型组比较，不同配伍补中益气汤药物组能明显降低p-p38 MAPK 蛋白的表达，提高大鼠空肠紧密连接蛋白ZO-1 和Occludin 的表达；补中益气汤缺柴胡组p-p38 MAPK、Occludin 蛋白表达与全方组比较，差异无统计学意义，提示升麻、柴胡作为引经药可能通过调节空肠黏膜屏障蛋白的表达，降低空肠组织通透性发挥引经增效作用，且升麻的引经增效作用优于柴胡。

综上所述，补中益气汤可明显改善脾虚泄泻，方中升麻、柴胡可增强补中益气汤的药效，其机制可能与调节胃肠功能、恢复免疫功能紊乱及上调空肠紧密连接蛋白表达有关。现代实验研究[7，30]表明引经药可能通过提高靶组织中的药物分布发挥引经作用，升麻、柴胡作为引经药在补中益气汤中具有增强疗效的作用，但其是否通过增加有效成分在相关组织的分布发挥引经作用尚需进一步研究。