胶质母细胞瘤相关pTERT突变的研究进展

蒋谷峰 综述 周 杰 审校

胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）在中枢神经系统肿瘤中的发病率及恶性程度最高。端粒酶是一种依赖核糖核酸的脱氧核糖核酸聚合酶，主要由两个亚基组成，即端粒酶逆转录酶（telomerase reverse tranase，TERT）和RNA。TERT 是端粒酶全酶的核心催化亚基，可通过从头合成将TTAGGG 重复序列添加到端粒上，从而对抗端粒丢失，最终使细胞无限增殖[1]。TERT 在大多数正常成人细胞中由TERT 启动子（TERT-promoter，pTERT）的转录抑制而失活，但在中枢神经系统肿瘤中却普遍活跃，尤其是GBM。pTERT 突变通过相关机制可重新激活TERT，在GBM 发生、发展中起关键作用。本文就GBM相关pTERT突变分子机制进行总结，并分析其在GBM 中的相关作用，为pTERT 在GBM 的诊断、预后判断及治疗上提供参考。

1 pTERT突变的发病机制

1.1 C228T和C250T突变TERT基因位于体细胞的5号染色体短臂上，由16 个外显子和15 个内含子组成，分别为C228T 和C250T。这两种突变是相互排斥的，任何一种突变均会增加TERT 的表达，从而增加端粒酶的活性。它们在所有亚型的胶质瘤中发生率均很高，尤其是原发性GBM，突变率达70%。这两种突变均产生一条完全相同的碱基对序列，包含ETS 转录因子结合基序，可从ETS 家族招募转录因子。ETS 家族成员包括ETS1、ETS2、GABPA、GAB⁃PB、ETV1、ETV4和ETV5，其中GABPA参与TERT的转录激活。敲除GABPA 的基因表达显著降低突变型启动子的活性，却不影响野生型启动子的活性[2]。体外细胞培养实验也同时表明，突变型pTERT 需要一个四聚体形成的β1L 亚型的GABPA 进行激活，而野生型pTERT不需要，因此GABPA 是GBM中TERT表达的关键转录因子。另外，pTERT 还存在其他更罕见的突变，包括C249T和C228A，但这些突变并不会产生ETS转录因子的结合位点。

1.2 pTERT 甲基化大多数GBM 都存在端粒酶RNA基因（telomerase RNA component，TERC）和TERT 的高表达。研究发现，TERC 和TERT 表达水平升高与儿童非脑干GBM的预后较差有关，但与成人GBM相比，儿童GBM 的pTERT 改变却非常罕见，这可能是由于端粒酶在成年前的干细胞和祖细胞中活跃而不需要通过TERT 突变来上调端粒酶活性；此外，pTERT甲基化与儿童脑肿瘤及野生型GBM中TERT表达增加密切相关[3]。这表明某些pTERT 野生型GBM 及儿童GBM 的TERT 的上调可以用pTERT 甲基化来解释，但这一发现与启动子突变的典型作用相反，因为在启动子甲基化中，甲基化通常会沉默相关基因的表达。

1.3 端粒重复序列结合因子（telomeric repeat binding factor，TRF）2-G-四链（pTERT）成人GBM存在非端粒的DNA 结合因子，包括TRF1、TRF2和Ras相关蛋白1，其中大部分由G-四链的非双链结构组成。研究表明，pTERT 突变能破坏TRF2 与GBM 中pTERT的G-四链结合[4]，使TERT抑制解除，当加入G-四链体稳定配体，TRF2 结合重新获得，并重新抑制携带pTERT突变的端粒酶。

1.4 pTERT 突变的时间节点研究表明，C228T 和C250T 突变可以将pTERT 的转录活性上调2～4 倍，而且GBM中pTERT mRNA及TERT表达水平高于正常人脑细胞，表明GBM 中pTERT 突变导致TERT 表达上调。然而，pTERT突变发生在GBM的早期还是晚期，尚不明确。虽然TERT在GBM中表达升高，但pTERT突变GBM的端粒比对照组却更短，表明这些突变可能发生在癌变之后。Ackermann 等[5]研究表明突变在同一病人不同肿瘤病灶中高频率出现，比较瘤周组织（脑室下区）、肿瘤组织与匹配的正常组织发现，瘤周区域早已有pTERT突变，可能是肿瘤的起源。因此GBM早期可能会通过PTEN的基因复制丢失与TERT突变共同作用进展为一种的癌变前体，最终引发GBM。

2 预后预测

2.1 pTERT单核苷酸多态性（SNPrs2853669）pTERT的单核苷酸多态性SNPrs2853669包括纯合子C/C突变和野生型T/T等，通过调控其他途径导致与预后相关。一项对126 例GBM 的研究表明，携带SN⁃Prs2853669 的pTERT 突变亚组比SNPrs2853669 非携带者的中位生存期更长；然而，当SNPrs2853669发生C/C 纯合子变异时，尤其是在C228T 或C250T pTERT 突变存在的情况下，生存期显著缩短[6]。这提示携带SNPrs2853669 可能是pTERT 突变相关GBM 的有利预后因素，而当SNPrs2853669 发生C/C纯合子突变时，使ETS2 结合位点的破坏和TERT 表达降低，最终导致端粒酶活性低于野生型T/T 纯合子，因此SNPrs2853669 C/C 纯合子基因型可作为pTERT突变病人短期生存期的独立预测因素。但目前仍缺乏关于SNPrs2853669 野生型纯合子T/T 对pTERT 突变相关GBM 病人生存率是否有影响的研究。

2.2 pTERT 突变与其他基因关联pTERT 突变具有独立负性预后影响。Dono 等[7]同时观察异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）和pTERT突变的GBM，发现即使在没有IDH 突变的肿瘤中，GBM 的pTERT 突变也预示着低存活率，且同时携带pTERT突变型和IDH 野生型肿瘤的总体生存期最差。Bol⁃lam 等[8]发现pTERT 突变的存在不是预后不良的独立影响因素，表现为IDH 突变型和IDH 野生型GBM无显著差异。因此，pTERT能否作为预测GBM的预后独立因素暂无定论。

研究表明，pTERT 突变的负面影响与共同存在的分子和临床因素有关，如年龄、IDH-wt 状态和未甲基化的O6-甲基鸟嘌呤DNA 甲基转移酶（O6-methylguanine- DNA methyltransferase，MGMT）状态。研究表明，这些因素未能观察到与pTERT 突变的存在有统计学意义的独立的生存关联。刘千琪等[9]发现，pTERT 突变的存在与总体生存期无关，GBM的pTERT 突变与IDH1/2 突变同时发生的频率较低（11.5%），同时野生型IDH1/2 联合pTERT 突变的GBM 病人总体生存期较IDH1/2 突变联合pTERT 突变的GBM低。此外，pTERT突变型与上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）扩增高度相关（44.1%），且EGFRⅧ在24%～67%的GBM 中表达，当GBM 中EGFR 扩增及pTERT 突变同时存在时，病人总体生存期明显下降。在GBM 中，pTERT突变与MGMT 启动子甲基化同时发生的概率为43.6%，MGMT 启动子未甲基化较低级别胶质瘤高，表明MGMT 未甲基化与pTERT 突变共存是GBM 的预后不良因素[10]。

3 辅助诊断技术

3.1 MRI 的诊断价值一项对60 例GBM 的MRI 的研究发现，GBM 未显示TERTp-mut 与肿瘤部位相关；但对于原发性中枢神经系统淋巴瘤的MRI 分析显示，TERTp-mut 更常累及胼胝体压部；此外，联合分析IDH1/2 和pTERT 突变状态可以区分胶质病变是GBM 还是反应性胶质增生，反应性胶质增生样本不包含pTERT区域的C228T或C250T突变[11]。

3.2 检测pTERT 的新兴技术2016 年WHO 对GBM的分类仍基于IDH，分为IDH野生型GBM、IDH突变型GBM 和未另行指定的GBM。随后，TERTp 突变、EGFR突变和MGMTp甲基化可通过体液活检肿瘤分子谱整合到临床诊断中。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）在血液和体液中的释放取决于肿瘤的位置、大小和肿瘤的血管浸润[12]，因此通过血液、脑脊液、尿液和其他体液检测和分离循环肿瘤细胞和ctDNA，间断分析ctDNA可提供肿瘤成分、异质性、预后生物标记物及其与其他临床相关癌症生物标记物的关系等信息。液体活检中的ctDNA水平因人而异，通过间断的ctDNA监测，同时利用液滴式数字PCR 分析检测pTERT 突变，可评估GBM 的进展，使pTERT突变作为未来个体化诊治的生物标志物成为可能。

4 靶点治疗

4.1 端粒酶抑制剂由于端粒缩短的生理病理机制，TERT抑制可能在经历多个细胞周期后才发挥作用，因此限制了端粒酶抑制剂的应用。目前，这种靶向治疗在癌症中没有得到批准。伊美司他是一种小型的TERT抑制剂，在治疗原发性血小板减少症方面显示出明确的疗效，同时在GBM 细胞系中，长期伊美司他治疗可导致GBM 肿瘤起始细胞的进行性端粒缩短、增殖率降低和诱导细胞死亡；另外，伊美司他联合放疗和替莫唑胺化疗对GBM 细胞存活率有显著影响[13]。然而，一项针对儿童难治性中枢神经系统肿瘤的临床试验，因出现治疗相关的血小板减少继发的肿瘤内出血而过被迫停止。同时，另一项临床前研究表明，治疗转移性乳腺癌中经常使用的微管抑制剂灯盏花素作为一种微管抑制剂，也被证明对依赖TERT-RNA 的RNA 聚合酶具有特异的抑制活性[14]，可以抑制pTERT 突变的GBM 细胞系的生长，并显著延长小鼠的生存时间，但缺乏临床试验。靶向GABPβ1L而非TERT本身可能是灯盏花素靶向治疗TERTP 突变细胞的一种方向，且同时保留正常细胞以避免伊美司他的引起的造血功能障碍。在一项GBM 细胞系研究中，破坏β1L 亚型可以逆转TERTp 突变的GBM 细胞的无限复制[15]。在小鼠GBM的异种移植模型中，敲除GABPβ1L会削弱肿瘤的生长并提高小鼠的存活率。此外，BIBR1532作为一种可破坏β1L 亚型有效的端粒酶抑制剂，可以通过在转录和翻译水平下调端粒酶活性来诱导细胞凋亡[16]，但还没有可用的临床数据或临床试验。

4.2 TERT 活性靶向疫苗一项从自体肿瘤干细胞培养中提纯的RNA 转染的树突状细胞的试验表明[17]，所有接受治疗的细胞均出现了免疫反应，没有明显的毒性或自身免疫的迹象；接种疫苗的病人的无进展生存期明显更长，经过2年的随访，7例中有5例存活。一项Ⅱ期临床试验表明，树突状细胞疫苗（den⁃tritic cell vaccine，DCV）没有显著改善43 例GBM 病人的总体生存期或无进展生存期，在调整B7-H4 的表达后，DCV 改善总体生存期，这是由于B7 分子是肿瘤微环境中重要的免疫逃逸介质，其中B7-H4 在高级别胶质瘤中高表达，可阻断有效的T 细胞免疫反应。因此，DCV 可作为治疗pTERT 突变肿瘤的GBM 的首选疫苗。同时，UCPVax 作为一种基于端粒酶衍生辅助肽的治疗性抗癌疫苗，可诱导Th1CD4T 细胞的强烈反应[18]，尽管Ⅰ期试验结果尚未公布，但这种这种疫苗被证实是安全的，未来将可能替代DCV成为治疗GBM的首选活性靶向疫苗。

综上所述，pTERT 突变作为GBM 发生、发展的最重要机制之一，对于大部分成年GBM，其可通过突变后的碱基序列招募GABPA 转录因子或通过破坏TRF2 与pTERT 的G-四链结合来激活TERT 活性，然后通过PTEN 的基因复制丢失（杂合子缺失）与TERT 突变共同作用进展为一种的癌变前体，最终引发GBM。而对于小部分的儿童GBM 及野生型GBM，其机制可能为pTERT的甲基化。其次，pTERT对于能否预测GBM病人预后，仍存在争议。但若同时携带SNPrs2853669的pTERT突变的GBM，比非携带者的预后更好，当SNPrs2853669 发生纯合子C/C突变时，存活率明显降低。再者，当pTERT 突变同时携带IDH 野生型、pTERT 突变、GFR 扩增、MGMT未甲基化其中之一者，预后更差。pTERT 对于头颅MRI的意义表现为TERTp-mut原发性中枢神经系统淋巴瘤病例更常累及胼胝体压部，联合分析IDH1/2状态可以区分胶质病变是GBM 与反应性胶质增生。间断液体活检及液滴式数字PCR分析对个体化诊疗及判断预后具有重要的意义。靶向作用于GABPβ1L 可能是灯盏花素靶向治疗TERTP 突变细胞的一种方向，且同时保留正常细胞以避免伊美司他的引起的造血功能障碍，已逐渐形成取代伊美司他的趋势。此外，BIBR1532可通过在转录和翻译水平下调端粒酶活性诱导细胞凋亡达到治疗效果，也将成为研究的热点。就免疫靶向活疫苗来说，DCV可作为治疗B7-H4 分子低表达的pTERT 突变肿瘤的GBM 的首选方案，而UCPVax 作为一种基于端粒酶衍生辅助肽的治疗性抗癌疫苗，亦在未来有可能取代DCV。