H5N1（NIBRG-14）流感病毒疫苗株在无血清悬浮培养MDCK细胞中传代稳定性的评价

张国梅，乐洋，张哲罡，马宁，李雪丹，周蓉，贾兰馨，郑嘉昊，张家友，杨晓明

1.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北武汉 430207；2.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北武汉 430207；3.中国生物技术股份有限公司，北京100029

MDCK 细胞经无血清培养基培养训化后获得的1株悬浮细胞，即sMDCK 细胞，该细胞具有流感病毒易感性。与贴壁细胞比较，悬浮细胞更利于实现生物反应器的线性放大培养，且无血清培养基在疫苗生产中具有更好的稳定性和安全性［1-4］。

2003—2022年间，全球有865人感染H5N1型流感病毒，其中457 人死亡［5］。目前，接种流感疫苗仍是预防流感大流行最有效手段［6-9］。H5N1（NIBRG-14）流感病毒疫苗株是通过反向遗传学方法制备获得的毒株，是WHO推荐用于制备灭活H5N1流感疫苗的疫苗株之一。流感病毒由8个不连续片段单股负链RNA分别编码的HA、NA、M1、M2、NP、PB1、PB2、PA 蛋白构成，其表面抗原血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）易发生变异，可导致流感病毒抗原漂移（antigenic drift）或抗原转换（antigenic shift）［10-11］。为防止疫苗株在传代过程中发生适应性突变，导致疫苗免疫原性不同于流行株从而造成疫苗保护率的下降［12］，《中国药典》三部（2020版）规定，成品疫苗病毒总传代次数不得超过5 代，以此来确保疫苗株的遗传性及免疫原性稳定。本研究通过检测H5N1（NIBRG-14）流感病毒疫苗株在sMDCK 细胞中连续传15 代病毒的核苷酸序列、病毒主要中和抗原的氨基酸序列及多代次病毒制备的疫苗在小鼠体内产生的中和抗体效价来判定该毒株在sMDCK 细胞中有限传代的稳定性，评价其作为sMDCK 细胞基质大流行流感疫苗生产用毒株的可行性。

1 材料与方法

1.1细胞、病毒、菌株及载体 MDCK（ATCC-CCL-34）细胞购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）；sMDCK 细胞由武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室保存；H5N1（NIBRG-14）流感病毒疫苗株购自英国国家生物制品检定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC），主种子批及工作种子批由武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室保存并提供；感受态E.coliTop10 购自生工生物工程（上海）股份有限公司；载体pMD18-T 购自普如汀生物技术（北京）公司。

1.2主要试剂及仪器 无血清悬浮培养基购自兰州百灵生物技术有限公司；结晶紫及TPCK-胰酶均购自美国Sigma 公司；青霉素-链霉素购自生工生物工程（上海）股份有限公司；RNA抽提试剂盒购自日本TaKaRa公司；二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）及碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）均购自北京索莱宝科技有限公司；β-丙内酯购自德国SERVA公司；HindⅢ和SalⅠ限制性内切酶购自英国Biolabs公司；Triton X-100、高效液相及高分辨质谱仪均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；分子筛及离子交换层析介质均购自美国GE公司。

1.3实验动物 SPF 级BALB／c 小鼠，雌性，6 周龄，体质量20～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号为：2021-0011。本实验均以科研为目的进行小鼠养殖和使用，且按照武汉生物制品研究所有限责任公司实验动物福利伦理审查委员会动物伦理相关规定进行（文件号为：WIBP-AⅡ312022003）。

1.4病毒传代 复苏sMDCK 细胞，用无血清悬浮培养基于37 ℃进行悬浮培养，每天更换培养基，连续培养3 d，按1∶9 的比例进行传代，取第3 代细胞进行后续试验。将对数生长期的sMDCK 细胞按5 ×105个／mL 接种至250 mL 摇瓶，37 ℃培养至细胞密度达（3 ～5）× 106个／mL 时，按MOI = 0.001 接种H5N1（NIBRG-14）流感病毒疫苗株工作种子批，加入TPCK-胰酶至终浓度2 µg／mL，于34 ℃，5% CO2摇床培养箱中培养72 h，收获病毒液，即P1 代病毒，按上述方法连续传15代。

1.5二代测序 采用RNA 抽提试剂盒提取主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10、P15 代病毒的RNA，委托武汉生物样本库有限公司武汉国家级人类遗传资源库进行二代测序，测序质量值≥30 可确保碱基正确识别率达99.9%。

1.6一代测序

1.6.1引物设计及合成 在全球共享流感数据倡议组织（Global Initiative of Sharing All Influenza Data，GISAID）官网下载H5N1（NIBRG-14）流感病毒疫苗株基因序列，应用Primer Premier 5软件设计引物，引物序列见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.6.2目的基因的扩增 采用RNA 抽提试剂盒提取主种子批、P1、P2、P3、P5、P10、P15代病毒的RNA，反转录合成cDNA，以其为模板PCR扩增HA、NA、M、NP、NS、PA、PB1、PB2基因。PCR 反应体系为：2 × GC Buffer Ⅰ12.5 µL，引物F／R（10 µmol／L）各0.5 µL，dNTP（10 mmol／L）0.2 µL，ddH2O 10.1 µL，cDNA 1µL，Taq 酶（5 U／µL）0.2µL，共25µL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共33个循环；72 ℃再延伸8 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6.3质粒的构建及鉴定 将目的基因及载体pMD18-T均经HindⅢ和SalⅠ双酶切后，回收目的基因及载体片段，以T4 DNA 连接酶于16 ℃连接过夜；连接产物转化感受态E.coliTop10，37 ℃孵育12 h；挑取单菌落，以pMD18-T 载体的通用引物进行菌落PCR鉴定。PCR 反应体系为：10×Taq Buffer 2.5µL，引物F／R（10 µmol／L）各0.5 µL，dNTP（10 mmol／L）0.5µL，ddH2O 19.8µL，cDNA 1µL，Taq 酶（5 U／µL）0.2 µL，共25µL。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共25 个循环；72 ℃再延伸11 min。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，并应用Snapgene 3.2.1 软件比对P1、P2、P3、P5、P10 和P15 代病毒8 个基因片段与主种子批的一致性。

1.7流感病毒HA及NA肽段覆盖率的检测 取P5及P15代病毒，56 ℃灭活30 min。取100µL灭活病毒液，加入10 mmol／L的DTT进行还原，74 ℃反应30 min；加入20 mmol／L 的IAA，室温反应30 min，封闭游离半胱氨酸残基；加入10 mmol／L 的DTT，中和多余IAA 后，进行多酶解（Trypsin、Glu-C 及Chymotrypsin酶）反应；酶切样品经高效液相分离后采用高分辨质谱仪进行检测，应用PEAKS Studio 10.0 软件对酶切肽段进行表征分析。

1.8免疫原性检测 取工作种子批、P5和P15代病毒，经分子筛、离子交换层析、β-丙内酯灭活层析后，用（10.0±1.0）%的Triton X-100裂解，制备为疫苗原液。经肌内注射免疫小鼠，每组10 只，15 µg HA／只，28 d 后加强免疫1 次，剂量及途径同初次免疫。分别于初次免疫后28、42、56 d，经小鼠眼眶后静脉丛采血，分离血清。将MDCK细胞按1.5×104个／孔加入96孔板，37 ℃，5%CO2培养箱培养24 h；PBS洗涤2次，加入小鼠血清（2倍稀释，共11个稀释度），同时设阴性对照（未稀释血清），50µL／孔；加入200 CCID50／100 µL的H5N1（NIBRG-14）流感病毒疫苗株工作种子批，50µL／孔，混匀，封膜，于34 ℃，5%CO2培养箱培养3～5 d；弃孔内液体，用100 µL 的1%结晶紫溶液染色10 min，以孔底显示蓝色（完全中和病毒）的相应血清稀释倍数作为中和抗体效价。

1.9统计学分析 应用GraphPad Prism 9.0 软件进行统计学分析，中和抗体效价结果采用均值±标准差（）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1二代测序结果 经测序，主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10及P15代病毒过滤后质量值≥30 的碱基数目占总碱基数目的94.94%、94.87%、95.00%、95.01%、95.08%、94.85%、94.87%和95.31%。各代次病毒RNA 测序深度均不低于30 ×的碱基数均占参考基因组长度的100%。主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10 代病毒均未发生单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）突变，但P15 代流感病毒的杂合SNP 有11 个，占非缺失位点数目的91.62%，与参考序列不一致的纯合SNP数目有1个，见表2。各代次流感病毒均未检测到片段插入或缺失。

表2 P15代H5N1流感病毒的SNP突变分析Tab. 2 SNP mutation analysis of P15 generation H5N1 influenza virus

2.2一代测序结果 各段基因PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，均可见相应目的基因条带，大小均与预期一致，且各代病毒间差异较小，见图1。P1、P2、P3、P5、P10 和P15 代病毒的HA、NA、M、NP、NS、PA、PB1、PB2基因片段长度分别为1 695、1 350、982、1 497、838、2 151、2 274、2 280 bp，与主种子批序列完全一致。

图1 H5N1（NIBRG-14）流感病毒疫苗株各段基因的PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of various gene segments of H5N1（NIBRG-14）influenza virus vaccine strain

2.3流感病毒HA及NA肽段的覆盖率 P5及P15代病毒的HA 肽段覆盖率分别为96.7%和99.0%，NA肽段覆盖率分别为100.0%和98%。表明在传代过程中，HA和NA蛋白氨基酸序列未发生突变或缺失。

2.4免疫原性 初次免疫后28、42、56 d，工作种子批、P5 和P15 代病毒免疫小鼠血清中和抗体效价差异均无统计学意义（H分别为2.253、2.029、1.408、P分别为0.324、0.363、0.495），见图2。表明不同代次病毒制备的疫苗免疫原性在15代内相对稳定。

图2 各组小鼠血清中和抗体滴度Fig. 2 Titers of serum neutralizing antibody of mice in various groups

3 讨论

以细胞为基质制备的流感疫苗具有质量可控、适用大规模生产及流感病毒较少发生适应性突变等优势。近年，WHO 积极推荐在流感病毒培养过程中用细胞培养来替代鸡胚培养［13-14］。目前，国外已有Solvay Pharmaceuticals（法国）、Med Immune（美国）、SK（韩国）和Novartis（瑞士）4家厂家获批以MDCK细胞为基质生产流感疫苗［15］，其中SK 与Novartis 公司均采用悬浮MDCK 细胞培养流感病毒。Novartis 公司制备的悬浮MDCK细胞流感疫苗Optaflu的临床数据显示，其安全性、免疫原性及耐受性均优于鸡胚基质流感疫苗［16］。与贴壁培养的细胞比较，悬浮培养的细胞能够进一步提高生产效率，并减少杂质引入［17］，近年已成为细胞基质流感疫苗研究的热点之一［18］。

以细胞为基质培养的流感病毒的稳定性显著高于鸡胚培养的病毒，但不同型别流感病毒在不同细胞基质中的传代稳定性仍存在差异［19-20］。TZENG等［21］对悬浮贴壁MDCK 细胞培养H7N9型流感病毒的HA抗原稳定性进行了比较，结果表明，两者均具有较好的稳定性；NAKAMURA 等［22］对流感病毒在悬浮和贴壁MDCK 细胞中的分离效率、生长能力、HA 与NA的遗传稳定性等进行了系统比较，结果表明，H1N1流感病毒在悬浮MDCK 细胞中HA 蛋白氨基酸突变率显著低于贴壁MDCK细胞，而H3N2及B-Yamagata分离株在悬浮及贴壁MDCK 细胞中传代均未发生HA 氨基酸突变，抗原稳定性良好。

目前，H5N1（NIBRG-14）流感病毒疫苗株已用于Vero细胞基质H5N1灭活疫苗的制备［23］，但在其他细胞基质中的培养效果鲜有报道。考虑到传代过程中酸碱度、温度、胰蛋白酶用量等因素可影响流感病毒的复制增殖［24-25］，本研究尽可能控制各影响因素保持一致，以排除细胞之外其他因素的影响。本研究将H5N1（NIBRG-14）流感病毒疫苗株在sMDCK 细胞中连续传代，从病毒核酸序列、氨基酸序列和相应疫苗免疫原性3 个方面评价其遗传稳定性。二代测序结果显示，各代次病毒的8 段RNA 均无插入或缺失片段，而SNP 检测结果显示，主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10代病毒均未发生SNP 突变，但P15代病毒多个基因位点存在单核苷酸突变的可能性，其中杂合SNP 数占91.62%。考虑到二代测序的深度及样品覆盖率等因素对检测结果的影响，本研究对各代次流感病毒核酸序列通过一代测序进一步验证二代测序中出现的P15 代病毒单核苷酸多态性，结果显示，各代次流感病毒检测到的基因序列与主种子批序列比对结果完全一致。综上所述，H5N1（NIBRG-14）流感病毒疫苗株在sMDCK 细胞中核酸序列遗传稳定性良好。蛋白质谱检测分析结果显示，P5 及P15 代病毒HA 及肽段覆盖率均＞95%，表明各代次流感病毒关键抗原蛋白HA 及NA 的氨基酸序列稳定。免疫原性检测结果显示，工作种子批、P5 及P15 代病毒制备的流感疫苗免疫小鼠后，同一时间点各组小鼠血清中和抗体效价差异无统计学意义（P均＞0.05）。表明H5N1（NIBRG-14）流感病毒在sMDCK 细胞中连续传代具有良好的稳定性，为sMDCK细胞基质流感疫苗的生产和制备奠定了基础。