小桃儿七中2个新的甾体类化合物

李玉泽，张东东，姜 祎，邓 翀，王 薇，刘建利，宋小妹*

• 化学成分 •

小桃儿七中2个新的甾体类化合物

李玉泽1，张东东1，姜 祎1，邓 翀1，王 薇1，刘建利2，宋小妹1*

1. 陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046 2. 西北大学生命科学学院，陕西 西安 710069

研究小桃儿七中的甾体类成分及其细胞毒性。采用多种现代分离色谱技术进行分离纯化，根据MS、IR和NMR等数据鉴定新化合物的结构，采用MTT法对新化合物的细胞毒活性进行筛选。从小桃儿七的正丁醇部位分离鉴定了2个甾体类化合物，分别鉴定为(25)-27--β--葡萄吡喃糖基-3,25-二羟基螺甾-5(6)-烯- 1β-yl--α--阿拉伯吡喃糖苷（1）和3β,14β-二羟基-3β-(2-羟基丙酰氧基)-5α-蟾酥甾-20,(22)-二烯（2），化合物2对人结肠癌HCT116细胞、人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）分别为（10.8±0.4）、（4.8±0.7）、（45.3±1.8）μmol/L。化合物1和2均为新化合物，分别命名为铁筷子苷M（thibetanoside M）和铁筷子苷N（thibetanoside N）；化合物2表现出较好的细胞毒活性。

小桃儿七；甾体皂苷；强心苷；细胞毒性；铁筷子苷M；铁筷子苷N

小桃儿七是毛茛科铁筷子属植物铁筷子Franch.的根及根茎，属于秦巴特色草药“太白七药”之一。铁筷子属植物全世界约有20余种，其中铁筷子为我国特产，分布于陕西、甘肃、湖北、四川等地，在陕西主要分布于秦岭山南北坡，具有清热解毒、活血散瘀、消肿止痛之功效，主要用于治疗跌打损伤、尿道炎及疮疖肿毒等[1]。

文献研究表明小桃儿七的主要化学成分为强心苷类、甾体皂苷类和植源性蜕皮甾酮类等[2-4]，具有强心、抗肿瘤、抗炎镇痛、抗菌及对呼吸中枢的兴奋等药理作用[5-6]。其中强心苷类成分是小桃儿七抗肿瘤的主要活性成分，逐渐受到国内外重点关注[7-9]。前期研究发现小桃儿七主要活性成分集中在正丁醇萃取部位，故本实验对小桃儿七正丁醇部位进行分离纯化，从中鉴定了2个新化合物分别为(25)-27-- β--葡萄吡喃糖基-3,25-二羟基螺甾-5(6)-烯- 1β-yl--α--阿拉伯吡喃糖苷[(25)-27--β-- glucopyranosyl-3,25-dihydroxyspirost-5(6)-en-1β-yl--α--arabinopyranoside，1]和3β,14β-二羟基-3β-(2-羟基丙酰氧基)-5α-蟾酥甾-20,(22)-二烯 [3β,14β- dihydroxy-3β-(lactate)-5αbufa-20,(22)-dienolide，2]，命名为铁筷子苷M和铁筷子苷N；细胞毒活性测试结果显示化合物2表现出较好的肿瘤细胞生长抑制作用。

1 仪器与材料

岛津半制备液相色谱仪（检测器：SAD-20A；泵：LC-6AD）；半制备液相色谱柱Ultimate XB-C18（250 mm×10 mm，5 μm，月旭科技上海股份有限公司）；Bruker AVANCE 400型核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）；色谱纯甲醇、乙腈（天津市科密欧化学试剂有限公司）；分析纯甲醇、三氯甲烷、石油醚（60～90 ℃）和正丁醇等试剂（天津市科密欧化学试剂有限公司）；氟尿嘧啶（5-FU，上海生物工程有限公司）；水为娃哈哈纯净水。人结肠癌细胞HCT116（ATCC目录号：CCL-247）、人肺癌细胞A549（ATCC目录号：CCL-185）、人肝癌细胞HepG2（ATCC目录号：HB-8065）购于中国科学院上海细胞库。

小桃儿七药材于2016年6月购于陕西眉县，经陕西中医药大学药学院王薇教授鉴定为毛茛科铁筷子属植物铁筷子Franch.的根及根茎，药材标本（20160915）保存于陕西中医药大学药学院中药标本馆。

2 方法

2.1 提取与分离

干燥的小桃儿七15 kg，粉碎后用10倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h。合并提取液，减压浓缩至浸膏，用水分散后，分别用石油醚和正丁醇萃取3次，得石油醚部位（20 g）和正丁醇部位（1.5 kg）。取正丁醇部位（500 g）经硅胶柱色谱分离，以三氯甲烷-甲醇-水（100∶0∶0～65∶35∶1）洗脱，合并相同流分，分别得到10个组分Fr.1～10。Fr. 1（40 g）经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯（1∶0～3∶1）梯度洗脱，得到3个组分Fr.1-1～1-3。Fr.1-3（1.3 g）再经凝胶柱色谱分离，三氯甲烷-甲醇（1∶1）等度洗脱，得到化合物2（8.3 mg）。Fr. 9（200 g）经硅胶柱色谱分离，三氯甲烷-甲醇（100∶0～2∶1）梯度洗脱，得到4个组分Fr. 9-1～9-4。Fr. 9-2（650 mg）经高效液相色谱（HPLC），乙腈-水（24∶76）洗脱得到化合物1（9.2 mg，R＝56 min）。

2.2 酸水解实验

化合物1称取3 mg，采用课题组前期水解和衍生化方法得到糖的衍生物[10-11]，经Agilent 7890B气相色谱仪分析，色谱柱：HP-5毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；程序升温：起始温度100 ℃，10 ℃/min升温至240 ℃，1 ℃/min 升温至260 ℃，保温10 min，2 ℃/min 升温至280 ℃，保温5 min；进样温度250 ℃；载气：氮气。测得各单糖的保留时间分别为21.30 min（-葡萄糖）和19.28 min（-阿拉伯糖）。

3 结构鉴定

图1 化合物1和2的结构

图2 化合物1的关键1H-1H COSY、HMBC和NOESY相关信号

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据 (400/100 MHz, C5D5N)

4 细胞毒实验

根据课题组前期研究[4]，采用MTT法分别测定化合物1和2对HCT116细胞、A549细胞和HepG2细胞的细胞毒活性，5-FU为阳性药。结果化合物2对3种肿瘤细胞的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）值分别为（10.8±0.4）、（4.8±0.7）、（45.3±1.8）μmol/L；化合物1对3种肿瘤细胞的IC50值均大于100 μmol/L；5-FU对3种肿瘤细胞的IC50值分别为（24.1±2.5）、（18.9±2.8）、（41.7±1.6）μmol/L。

图3 化合物2的关键HMBC和NOESY相关信号

表2 化合物2的1H-NMR和13C-NMR数据(400/100 MHz, C5D5N)

5 讨论

本实验从小桃儿七中共分离鉴定了2个新的甾体类化合物，生物活性表明化合物2对3种肿瘤细胞表现出了较好的抗肿瘤活性，后期可针对其抗肿瘤机制进行深入研究。以上结果丰富了小桃儿七化学成分，为进一步阐明小桃儿七药效物质基础提供参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 宋小妹, 刘海静. 太白七药研究与应用 [M]. 北京: 人民卫生出版社, 2011: 208-211.

[2] 张慧. 药用植物小桃儿七和秤杆七化学成分研究及生物活性初探 [D]. 天津: 天津大学, 2018.

[3] 王盈, 苏艳芳, 杨凤英, 等. 小桃儿七中的1个新化合物 [J]. 中草药, 2013, 44(13): 1713-1716.

[4] Li Y Z, Huang W L, Zhang H W,. Steroidal components from the roots and rhizomes of[J]., 2022, 50: 31-35.

[5] 李朋收, 范冰舵, 刘洋洋, 等. 铁筷子化学成分及药理作用研究进展 [J]. 中华中医药学刊, 2014, 32(6): 1286-1289.

[6] Zhang H, Wei Z Y, Li Z P,. Three new spirostanol glycosides from[J]., 2020, 34(7): 975-980.

[7] Ma L, Meng Y Y, Tu C H,. A cardiac glycoside HTF-1 isolated fromFranch displays potentanti-cancer activity via caspase-9, MAPK and PI3K-Akt-mTOR pathways [J]., 2018, 158: 743-752.

[8] Deng L J, Hu L P, Peng Q L,. Hellebrigenin induces cell cycle arrest and apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells through inhibition of Akt [J]., 2014, 219: 184-194.

[9] Hou Y N, Shang C S, Meng T T,. Anticancer potential of cardiac glycosides and steroid-azole hybrids [J]., 2021, 171: 108852.

[10] Zhang D D, Wang W, Li Y Z,. Two new pregnane glycosides from[J]., 2016, 15: 142-146.

[11] Song X M, Li Y Z, Zhang Z L,. Two new spirostanol glycosides from the roots and rhizomes ofFranch [J]., 2023(2): 318-328.

[12] Mai N T, Cuc N T, Anh H L,. Steroidal saponins from[J]., 2017, 121: 1-9.

[13] Liu X T, Wang Z Z, Xiao W,. Cholestane and spirostane glycosides from the rhizomes of[J]., 2008, 69(6): 1411-1418.

[14] Qin X J, Sun D J, Ni W,. Steroidal saponins with antimicrobial activity from stems and leaves ofvar.[J]., 2012, 77(12): 1242-1248.

[15] Zhou S W, Zheng Q F, Huang X Y,. Isolation and identification of/-lactate-conjugated bufadienolides from toad eggs revealing lactate racemization in amphibians [J]., 2017, 15(26): 5609-5615.

[16] Meng Y, Whiting P, Sik V,. Ecdysteroids and bufadienolides from(Ranunculaceae) [J]., 2001, 57(3): 401-407.

Two new steroidal constituents from roots and rhizomes of

LI Yu-ze1, ZHANG Dong-dong1, JIANG Yi1, DENG Chong1, WANG Wei1, LIU Jian-li2, SONG Xiao-mei1

1. School of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 2. College of Life Science, Northwest University, Xi’an 710069, China

To study the steroidal constituents from the roots and rhizomes ofand their cytotoxicity.A variety of modern separation chromatography techniques were used for separation and purification, and the structures of the new compounds were identified by MS, IR and NMR data, and their cytotoxic activities were screened by MTT method.Two new steroidal components were obtained from n-butanol fraction of ethanol extract ofand namely (25)-27--β--glucopyranosyl-3,25-dihydroxyspirost-5(6)-en-1β-yl--α--arabinopyranoside (1) and 3β,14β-dihydroxy- 3β-(lactate)-5αbufa-20,(22)-dienolide (2). The half inhibitory concentration (IC50) of compound 2 on human colon cancer HCT116 cells, human lung cancer A549 cells and human hepatocellular carcinoma HepG2 cells, respectively, was (10.8±0.4), A549 cells (4.8±0.7) and HepG 2 cells (45.3±1.8) μmol/L.Compounds 1 and 2 are new compounds named thibetanoside M and thibetanoside N, among which compound 2 exhibited moderate cytotoxicity.

Franch.; steroidal saponin; bufadienolide; cytotoxicity; thibetanoside M; thibetanoside N

R284.1

A

0253 - 2670(2023)15 - 4769 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.001

2023-03-09

陕西省中医药管理局项目（2021-02-22-017）；陕西省教育厅项目（22JK0344）；陕西中医药大学创新团队项目（2023-CXTD-05）

李玉泽（1990—），男，博士，讲师，研究方向为中药药效物质基础研究。E-mail: lyz1990yeah@163.com

通信作者：宋小妹（1963—），女，博士，教授，研究方向为中药药效物质基础研究。E-mail: songxiaom@126.com

[责任编辑 王文倩]