基于转录组测序揭示光质对刺五加实生苗基因表达的调控作用

张 爽，王谦博，郭盛磊，王振月*

• 药材与资源•

基于转录组测序揭示光质对刺五加实生苗基因表达的调控作用

张 爽1，王谦博2，郭盛磊3，王振月3*

1. 贵州中医药大学，贵州 贵阳 550000 2. 广东药科大学附属第一医院，广东 广州 510000 3. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040

目的 对刺五加实生苗进行转录组测序，分析其响应不同光质调控的分子机制。方法 以生长60 d的刺五加实生苗为材料，设置不同光质处理组（LED-1、LED-2）和对照组 [高压钠灯（high pressure sodium，HPS）]，应用Illumina HiSeqTM对其叶片进行转录组测序，对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）筛选和共表达网络分析。结果 转录组测序共获得126 252条Unigene。其中92 681条被注释，3个处理组中筛选出DEGs 7664个。基因本体（gene ontology，GO）富集结果表明，DEGs在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）途径富集分析表明，DEGs显著富集在植物激素传导、糖代谢、苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成。适度光质胁迫可以促进刺五加实生苗中苯丙素类化合物生物合成途径关键酶基因的表达，是促进刺五加有效成分累积的基础。结论 通过高通量转录组测序，揭示了不同光质对刺五加实生苗基因表达的调控特征，可为深入研究刺五加药效成分的生物合成机制及栽培中的光环境设置提供科学依据。

刺五加；光质；转录组测序；差异表达基因；转录因子

刺五加(Rupr. Maxim.) Harms为五加科多年生植物，以干燥根和根茎或茎入药，具有益气健脾、补肾安神等传统功效，于脾肺气虚、体虚乏力、食欲不振、肺肾两虚，久咳虚喘、肾虚腰膝酸痛、心脾不足、失眠多梦等症[1-2]。刺五加是我国传统大宗药材，药用历史悠久且市场需求量大，目前以人工栽培为主[3]。研究发现，适度的光胁迫不仅能促进刺五加生长，对刺五加中次生代谢产物的累积具有显著影响，但过多的光干预不利于植株的生长[4-5]。因此在刺五加的栽培过程中，通过合理的光质配比控制药材的产量和质量显得尤为重要。近年来随着高通量转录组测序技术的快速发展，通过比较多个样本间的差异表达基因，来探讨植物响应环境胁迫的分子机制已成为目前研究的热点[6-8]。光胁迫对植物形态结构、生理和生化反应的影响已有深入研究，但对次生代谢调控机制的研究还较少[9-10]。本研究以刺五加为材料，分别设置对照组和适度光质处理组，利用转录组测序和差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）分析和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，分析不同光质培养的刺五加幼苗转录组水平的变化，以期在从基因表达水平上揭示光质对刺五加幼苗生长发育影响的分子调控机制。

1 材料与仪器

1.1 材料

刺五加实生苗所用种子采自于黑龙江省七台河市（45°37′ N，31°15′ E），经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为刺五加(Rupr. Maxim.) Harms。

1.2 仪器

LED可控光质照射灯，长春智伦圃道农业科技有限公司；HPS型高压钠灯，湖州欧迪照明有限公司；Total RNA Extractor（Trizol），上海生工有限公司；Qubit2.0 RNA检测试剂盒，Life公司；Qubit2.0 DNA检测试剂盒，Life公司；4S Red Plus核酸染色剂，BBI Life Science公司；第一链cDNA合成试剂盒EP0733，Thermo Scientific™公司；SG Fast qPCR Master Mix（2×），BBI Life Science公司；VAHTSTM mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina®，南京诺唯赞公司；VAHTSTM DNA Clean Beads，南京诺唯赞公司；Q32866 Qubit 2.0荧光计，Invitrogen公司；WH-3 微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；Thermo Scientific Sorvall Legend Micro21R台式高速低温离心机，Thermo公司；Cycler T100™ Thermal PCR仪，BIO-RAD公司；DYY-11电泳仪，北京市六一仪器厂；H6-1型微型电泳槽，上海精益有机玻璃制品仪器厂；FR-980A型生物电泳图像分析系统，复日科技；SW-CJ-1D型洁净工作台，江苏苏洁净化设备厂；SMA4000型微量分光光度计，Merinton公司；StepOne型荧光定量PCR仪，ABI公司。

2 方法

2.1 样品处理

试验在该温室中进行，4月选取生长势一致的种苗移植于将其播种于以草炭土和珍珠岩的混合物为的栽培基质（3∶1，pH≈6.0）直径12 cm的营养钵中，每盆1株刺五加幼苗。为充分利用光照且互不遮蔽，将12个盆间隔构放置在一个托盘中，采用低水位灌溉自吸式供水；定植10 d后，将所有盆随机排列并放入3个操控架中，每个操控架设置不同光质的培养光源，进行不同光质处理。光质处理分别为LED-1、LED-2和对照光源高压钠灯（high pressure sodium，HPS），测得HPS灯的R/G/B的光合光子通量密度（PPFD）比为43.7∶54.6∶1.7；因此，LED-1处理用适当增加了蓝光配比的光谱（R/G/B，43.8∶47∶9.2）。LED-2处理增强了R光比（R/G/B，74.3∶12.5∶13.2）。每个操控架的所有内部空间被设置为16 h光周期，照明周期为5:00 am～21:00 pm。在整个实验中，监测相对湿度（RH）和温度分别为（70±10）%和25 ℃/18 ℃（白天/夜晚）。移动苗床上方55 cm处的PPFD为（94±5）μmol/(m2·s)。处理60 d后，分别采收对照组和光质处理的刺五加叶，洗净后用液氮速冻，置于−80 ℃保存备用。

2.2 总RNA的提取与转录组测序

取刺五加叶在液氮中研成粉末，用Total RNA Extractor（Trizol）提取试剂盒进行总RNA提取，并用Qubit 2.0检测RNA浓度，琼脂糖凝胶检测RNA完整性以及基因组污染情况。每处理3份生物学重复。将每处理3份样品等量混合，委托上海生工有限公司构建测序文库，并使用Illumina HiSeqTM测序平台进行转录组测序。

2.3 测序数据组装及Unigene功能注释

对原始测序数据进行滤过，去除测序接头、引物以及低质量的序列后，获得高质量的clean reads。使用Trinity软件将clean reads组装成contig，利用De Bruijn进一步简化后获得Unigene。然后使用BLAST软件将Unigene序列与Non-Redundant Protein Sequence Database（NR）、Swiss-Prot、基因本体（gene ontology，GO）、clusters of orthologous groups （）、真核生物蛋白相邻类的聚簇（Clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes，KOG）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库比对，获得Unigene的注释信息。

2.4 DEGs分析

使用FPKM（fragments per kilobase oftranscript per million mapped reads）计算Unigene的表达量，利用EBseq平台筛选叶中的DEGs基因，筛选条件为值≤0.05且差异倍数（fold change，FC）≥1.5。并对筛选出的DEGs进行GO、KEGG富集分析。

2.5 qRT-PCR验证

采用qRT-PCR的方法对刺五加生长和苯丙素类成分合成途径中的5个关键酶基因，在不同光质作用下对Daucus carota、PETH、GRH1、PAL3、GH31的PCR扩增引物设计见表1。qRT-PCR为20 μL反应体系，包括cDNA模板2 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、ddH2O 7.2 μL。检测、、、共4个皂苷合成相关酶基因的表达量，以在各处理组和对照组中表达比较稳定的管家基因作为内参基因，每个样品进行3个技术重复。基因表达量以HPS对照组的基因的表达量为1，采用2−ΔΔCt法计算。

表1 qRT-PCR引物

3 结果与分析

3.1 测序数据与基因注释

过滤原始数据后，各样品的30碱基百分比在95%以上，且GC含量均在50%左右。将clean reads进行组装共得到126 252条Unigene，Unigene的50为812，其中长度在1 kb以上的Unigene有17 932条。通过选择BLAST参数值≤1×10−5和HMMER参数值≤1×10−10，最终获得92 681个有注释信息的Unigene，约占Unigene总数的73.41%。Unigene与NCBI和NT数据库进行blastn比对，取值≤1×10−10并且相似度＞90%，coverage＞80%的比对结果，计算其物种分布，进行污染检测，目前刺五加全基因组测序尚未完成，NT数据库中刺五加的碱基序列有限，虽未比对到刺五加，但比对到的eads远远小于总reads数，足以说明本实验所有样品未受到其他物种污染。但HPS和LED-1所有样品的首位比对结果都是人参C. A. Mey.排在第1位，而LED-2处理组样品均是西洋参L.排在第1位，且前10位中HPS与LED-1品种相近，而与LED-2差别较大，表明不同处理方式对基因的注释信息具有一定影响。

3.2 Unigene总体差异分析

为了解光质对刺五加生理代谢影响的分子机制，采用DESeq进行分析研究2种光质培育刺五加幼苗与对照组间的显著性差异基因，将筛选的条件设定为∣FC∣＞1.5且值＜0.05。从3个处理中筛选得到7664个DEGs。与HPS对照组相比，LED-1组中筛选出3699个DEGs，其中2549个上调基因和1150个下调基因，LED-2组中筛选出2428个DEGs，1662个上调基因和766个下调基因，LED-1与LED-2相比筛选出1537个DEGs，893个上调基因和644个下调基因。将不同组样品中基因的差异倍数变化值绘制在横轴上，并将基因表达量值的变化的统计学显著性绘制在纵轴上。图1结果宏观显示，LED-1和LED-2组虽然差异基因少，但表达差异倍数较大，而HPS与LED-1组的表达差异倍数小，但是差异显著。

3.3 差异基因功能注释

为了阐释3种处理间差异基因的功能信息，根据GO、KOG和KEGG数据库进行注释。图2显示了DEG的GO分类结果，其总结为3类：生物过程，细胞组分和分子功能。在这些类别中，“细胞凋亡”“膜质体”“共质体”“营养库活性”“核酸结合转录因子活性”和“结合体”在各差异间均表现显著。其中“共质体”“核酸结合转录因子活性”和“电子载荷活性”呈显著减少趋势，“节律过程”、“抗氧化活性”和“营养库活性”被增加显著富集。此外，LED-1LED-2、HPSLED-2和HPSLED-1分别有484、939和1686个DEGs被注释于22个KOG分类中（图3）。在KOG中，“翻译后修饰和分子伴侣蛋白质周转”占最大比例，其次是“细胞壁、膜、包膜生物发生”和“次生代谢物生物合成、运输和分解代谢”，然而“细胞迁移”在LED-1LED-2和HPSLED-2之间没有响应基因。为了鉴定转录组中代表的潜在生物途径。将KEGG用于进一步分析。结果显示，LED-1 vs LED-2中有733个DEGs分配到189个KEGG途径，其中在“氧化磷酸化”“内质网中的蛋白质加工”和“核糖体”途径中显著富集。在HPSLED-1中，有1078个差异基因被注释在220个KEGG途径，其中在“氧化磷酸化”“氨基酸的生物合成”和“碳水化合物代谢”途径中显著富集。在HPSLED-1中，有1865个DEGs注释于248个KEGG途径，其中在“苯丙烷类生物合成”“植物-病原体相互作用”“植物激素信号转导”和“核糖体”显著富集。

a-HPS vs LED-1中DEGs b-HPS vs LED-2中DEGs c-LED-1 vs LED-2中DEGs 图中的每个点代表一个基因，其中红色表示上调基因，绿色表示下调基因，黑色表示非差异基因

3.4 DEGs功能富集分析

为了提高2种光质对刺五加生长影响研究可靠性，识别出生物现象最相关生物学途径，采用超几何分布对基因富集分析，找出2种光质处理后与HPS对照组相比较，表达水平有差异的基因集。结果表明，与HPS对照组相比，LED-1光质处理组苗具有值＜0.05的显著差异性基因集共392个，其中上调基因集273，下调基因集119个，在这些基因集所标注中可以看出，LED-1显著促进了刺五加细胞壁组织、细胞基质的合成过程，为刺五加生长提供了物质基础，而且，LED-1处理还促进了激素接到和激素传递等反应功能基因，并显著提高了细胞对激素表达刺激的基因表达，证明其有效促进了刺五加实生苗体内激素含量，具体激素类型可结合KEGG激素相关合成通路进行分析；LED-2光质处理组苗具有值＜0.05的显著差异性基因集共201个，其中上调基因集152个，下调基因集59个，LED-2光质与LED-1光质促进的基因集具有显著差异，LED-2光质似乎更有刺激刺五加实生苗光合系统的发育，其对叶绿体、类囊体的基因集具有显著影响，LED-2对于次生代谢产物具有非常显著的基因集提高，但由于LED-2光质的光能较强，对于刺五加实生苗具有一定的刺激作用，从显著的基因集中可以看出，其显著提高了应激性防御基因集的表达。根据显著富集的功能最高的前30个DEGs集绘制散点图，见图4。

3.5 光质对刺五加实生苗生长代谢相关通路影响

为深入探究2种光质模式对刺五加苗生长影响机制，分别将2处理组与HPS对照组的差异基因进行生长和营养代谢相关通路富集，研究发现LED-1处理光质对植物激素传导、糖代谢和类固醇生物合成等9条与生长相关通路有影响，其中4条具有显著性影响；LED-2处理对植物激素传导等7条与生长相关通路产生影响，但仅对植物激素方向具有显著性影响，通路名称、注释差异基因个数及显著性见表2。

a-HPS vs LED-1 DEGs b-HPS vs LED-2 DEGs c-LED-1 vs LED-2 DEGs

3.6 光质对刺五加实生苗次生代谢产物相关通路影响

为了深入了解2种生产模式光质对于刺五加苗次生代谢影响，分别将2处理组与HPS对照组的差异基因进行次生代谢相关通路富集，通路名称、注释差异基因个数及显著性见表3。结果表明，2种光质种植模式对于苯丙烷类生物合成、苯丙氨酸代谢和类黄酮生物合成均有极显著的影响，而这3条途径包括刺五加绝大多数的药效成分。此外，LED-2光质对于刺五加苗的次生代谢产物萜类合成，尤其是倍半萜类和三萜类化合物的生物合成具有显著影响。

A-HPS/LED-1 DEGs B-HPS/LED-2 DEGs C-LED-1/LED-2 DEGs

a-HPS/LED-1 DEGs b-HPS/LED-2 DEGs 纵坐标代表功能注释信息，横坐标表示对应的rich factor，q值大小由点颜色表示，颜色越深，q值越小，每个功能下包含的DEG多少用点大小表示

表2 不同处理与HPS对照组生长代谢显著差异通路

3.7 qRT-PCR验证基因表达

为验证转录组数据中差异表达基因的可靠性，选取了刺五加生长发育和苯丙氨酸类合成途径相关途径的3个关键酶基因进行qRT-PCR分析。结果如表4、5所示，根据2种光质不同处理中所选定的3条代谢相关途径，可以看出LED-1光质处理对于植物生理生长和苯丙氨酸类合成途径中的GRH1和PAL3与HPS对照组相比在刺五加苗体内极显著表达，LED-2处理组促生长和苯丙氨酸类化合物合成的相关基因GH31和PAL3表达量显著高于HPS对照组。这些基因qRT-PCR研究结果与转录组分析结果一致。

表3 不同光质处理组与HPS对照组次生代谢相关显著差异基因表达通路

表4 LED-1处理组与HPS对照组关键基因qRT-PCR结果

表5 LED-2处理组与HPS对照组关键基因qRT-PCR结果

4 讨论

光质对植物的生长和生理代谢至关重要，它不仅作为能量来源直接影响植物的光合作用，还是一种影响植物光形态建成和体内物质代谢活动主要触发信号[11]。近年来，LED灯光和不同颜色的滤光膜常被研究者用来探究光质对植物生长和次生代谢物质积累的影响。相对于滤光膜，LED灯光有着光谱波段更加精密的优点，备受学者们关注[12]。本研究通过比较其丰度和相关基因上调显著性和差异性，在分子机制研究过程中发现，LED-1光照处理对于刺五加生长和发育在分子水平表现出主要促进生理机制发生和激素水平，进而促进的刺五加苗的快速生长；而LED-2对于刺五加生长则有刺激性，虽然株高增长更快，但是却是一种类似于刺激性生长；这一点除了在次生代谢相关途径差别印证，与LED-1光质处理组差异基因注释通路明显不同，LED-2光质处理对于刺五加苗生长过程中，有多种应激性的促生长调节方式反馈。LED-2光质处理作为刺五加苗生长过程中一种环境胁迫，使得刺五加幼苗产生了一系列的防卫反应，有相当数量涉及到PPAR信号通路、TGF-β信号通路、Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路”等应激性反应生物学过程的unigene得到了差异表达。与此同时，涉及过氧物应激系统、钙离子、茉莉酸和苯丙氨酸等信号转导过程的unigene差异表达也非常显著。因此，基于转录组学和qRT-PCR的研究结果，认为LED-2光质影响刺五加苗的代谢轮廓是主要是通过这些信号转导基因的差异表达促使转录因子等基因表达水平发生变化，而PAL3作为PAL基因家族成员是参与苯丙烷代谢途径的重要酶，是生物合成苯丙烷类天然产物的第1步，而且可以参与植物色素的形成。本实验不同处理对于PAL3的表达量均有显著影响，且LED-1中表达量显著高于LED-2处理，这也印证了光质对于植物的刺激反应和激发植物体内“防御基因”，进而促进次生代谢产物的合成。

刺五加作为世界重要的药用植物，国内外研究者对其物质基础、药理活性及其药效学等方面展开了广泛而深入的研究。目前已有学者对于刺五加有效成分合成的关键基因进行克隆研究，但是目前还未见刺五加整个基因组信息公布，公共数据库可获得的刺五加基因组信息非常有限。因此，本实验通过基于Illumina HiseqTM测序平台，对刺五加叶转录组进行深度测序和de-novo组装，获得的unigene，与NR、SWISS-PROT等公共数据库进行比对和注释，建立了刺五加功能基因数据库。同时，对不同光质照射处理下的刺五加unigene的表达情况进行了深度分析，从中筛选出主要涉及信号转导、植物激素调控、糖代谢等生物学过程的差异表达unigene。本研究通过高通量转录组测序，初步揭示了光质改变对刺五加基因表达的调控特征，对其中一些关键基因和转录因子进行深入研究，可为刺五加药效成分的生物合成机制以及在大田生产育苗中的合理优化光环境提供科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Sequencing and analysis of transcriptome to reveal regulation of gene expression inseedling under light quality

ZHANG Shuang1, WANG Qian-bo2, GUO Sheng-lei3, WANG Zhen-yue3

1. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550000, China 2. The First Affiliated Hospital/School of Clinical Medicine of Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510000, China 3. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

To analyze the molecular mechanism of different tissues of Ciwujia ()seedlingin response to light quality by transcriptome sequencing.The seedlings of 60 dfrom moderate light quality group and control group (LED-1, LED-2) were used as the test material. And the transcriptome sequencing analysis was carried out by using Illumina HiSeqTM. After obtaining transcriptome data, gene function annotation, differentially expressed genes (DEGs) screening and and co-expression network analysis were performed.A total of 126 252 unigenes were obtained by transcriptome sequencing. Among them, 92 681 unigenes were annotated, and 7664 DEGs were screened out from three treatment groups. The GO enrichment results showed that the DEGs of the roots and leaves were both significantly enriched in metabolic process, stimulus response, cell structure, catalytic activity and other functions. The KEGG pathway enrichment analysis showed that DEGs in leaves were mainly concentrated in phytohormone transduction, sugar metabolism, phenylpropanoid biosynthesis, and flavonoid biosynthesis. Moderate light quality stress can promote the expression of key enzyme genes of phenylpropanoid biosynthesis pathway inseedlings, which is the basis for promoting the accumulation of effective components of.The high-throughput transcriptome sequencing revealed the regulatory characteristics of light quality stress on gene expression in different tissues of, which could provide scientific basis for further research on the biosynthesis mechanism of medicinal components ofand reasonable luminous environment in cultivation.

(Rupr. et Maxim.) Harms; light quality; transcriptome sequencing; differentially expressed genes; transcription factors

R286.12

A

0253 - 2670(2023)15 - 4973 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.022

2023-02-03

“十三五”国家重点研发计划（2016YFC0500303）

张 爽（1991—），女，汉族，博士，讲师，研究方向为中药资源与栽培方向。E-mail: rocmsw@163.com

通信作者：王振月，男，教授，从事中药资源研究方向。E-mail: wangzhen_yue@163.com

[责任编辑 时圣明]