小麦粉中呕吐毒素检测能力验证及关键点分析

◎ 李丽丽，周 雪，李 劲，付锦华

（营口市食品药品检验检测中心，辽宁 营口 115003）

呕吐毒素，天然产生且化学性质稳定，是谷物赤霉病的重要指示性毒素。呕吐毒素广泛污染小麦、玉米等粮食作物和饲料，是污染最为普遍和严重的真菌毒素之一[1]。呕吐毒素能损害机体免疫系统，导致人和动物出现呕吐、腹泻等中毒症状[2]。我国目前明确规定谷物及其制品中呕吐毒素限量为1 000 μg / kg[3]，而呕吐毒素也是辽宁省储备粮日常监控和出入库必检项目之一。作为储备粮承检单位，提高实验室真菌毒素的检测能力、加强检测过程质量控制对保障粮食安全具有重要意义。

为进一步提高检验检测能力，营口市食品药品检验检测中心于2022年参加了由中国检验检疫研究院组织的小麦粉中呕吐毒素能力验证考核，本文以此次能力验证为契机，对小麦粉中呕吐毒素含量进行测定并对实验过程关键点予以总结。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与耗材

Agilent-1260 高效液相色谱仪：配紫外可见光检测器，美国安捷伦公司；QUINTIX124-1CN 电子天平：德国赛多利斯公司；ST16 高速冷冻离心机：德国赛默飞公司；Multi Reax 全能型振荡器：德国海道夫公司；MING-CHE 24UV 超纯水机：德国默克密理博公司；NS-10 氮吹仪：上海屹尧仪器公司；可调移液器：普兰德公司；0.45 μm微孔滤膜：美国欧姆尼公司；玻璃纤维滤纸：英国沃特曼公司；免疫亲和柱：Romer 公司。

1.2 标准品与试剂

实验呕吐毒素标准品（CAS：51481-10-8）：100.0 μg/mL，Romer。

聚乙二醇：天津光复研究所；甲醇：色谱纯，德国默克公司；磷酸缓冲盐溶液：由氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钠、超纯水按一定比例配置，用盐酸将pH值调至7.0，涉及药品试剂均来自天津科密欧公司。

1.3 能力验证及质控样品

能力验证考核样品：由铝塑袋真空包装含未知浓度呕吐毒素的小麦粉样品2 份，计划编号ACASPT1463，样品编码分别为22-A255 和22-B334，每份样品质量约60 g，由中国检验检疫研究院提供。

能力验证质控样品：由铝塑袋真空包装含呕吐毒素浓度为677 μg/kg 的小麦粉样品一份，编号QC-WM-703，样品质量约50 g，购于中国检验检疫研究院。

1.4 实验方法

1.4.1 依据标准

本试验依据《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》（GB 5009.111—2016）[4]第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法并结合作业指导书要求进行检测。

1.4.2 样品提取

待测样品充分混匀后称取5 g 于50 mL 离心管中，依次加入1 g 聚乙二醇和25 mL 水，混匀，振荡提取20 min。6 000 r/min 离心10 min，玻璃纤维滤纸过滤后收集滤液于50 mL 离心管中，10 000 r/min 离心5 min，待净化。

1.4.3 样品净化

免疫亲和柱恢复至室温。待免疫亲和柱内原有液体流尽后，准确移取上述滤液2.0 mL 至免疫亲和柱中。控制样液以每秒1 滴的速度通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。用5 mL PBS 缓冲盐溶液和5 mL 水先后淋洗免疫亲和柱，抽干小柱。

1.4.4 样品洗脱

准确加入2 mL 甲醇洗脱免疫亲和柱，控制每秒1 滴的下滴速度，收集全部洗脱液于试管中。50 ℃下氮气吹至近干，加入1.0 mL 初始流动相，涡旋30 s 溶解残留物，0.45 μm 滤膜过滤，收集滤液，液相色谱仪紫外检测器测定。

1.4.5 仪器参数

色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm 粒度5 μm），美国安捷伦公司；柱温：35 ℃；进样量：50 μL；流速：0.8 mL/min；检测波长：218 nm；流动相：甲醇+水（20+80）。

2 结果与分析

2.1 预实验及标准曲线

结合预实验测得值和质控样含量，分别配制浓度为50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL 的标准系列工作液，共6 点，液相色谱仪依次进样50 μL，外标法定量。以呕吐毒素质量浓度为X轴、呕吐毒素液相色谱仪测得峰面积为Y轴绘制标准曲线，同时得线性回归方程及相关系数，见图1。结果显示，在50～500 ng/mL 范围内标准曲线线性关系良好。

图1 呕吐毒素标准曲线及线性方程图

2.2 质控及能力验证样品测定

按上述试验条件，平行测定质控样中呕吐毒素含量6 次，计算结果回收率及变异系数，以此验证方法的准确度和稳定性。结果显示，质控样品测定结果、回收率及变异系数均在标准要求范围内[5]，实验方法及仪器性能均可靠。

根据给定考核样品质量及作业指导书要求，按上述试验条件，两份能力验证样品分别平行测定5 次，计算呕吐毒素质量浓度，取平均值作为最终呈报结果，检测数据见表1。

表1 呕吐毒素质控及能力验证样品检测数据表

2.3 能力验证考核结果

本次能力验证结果考核采用Z比分数法[6]。组织单位通过统计参与实验室反馈数据计算出考核样品指定值及各实验室反馈数据的Z值。评判标准为：Z绝对值越接近于 0, 则表示该结果符合性越好。当∣Z∣≤2.0 为满意结果，当2.0 ＜∣Z∣＜3.0 为可疑结果，∣Z∣≥3.0 为不满意（离群）结果。本实验室2 个样品检测数据结果反馈均为满意结果，数据见表2。

表2 呕吐毒素能力验证检测结果及评价表

2.4 关键点分析

2.4.1 作业指导书

实验人员收到能力验证考核样后，应第一时间对待测样品进行查验，仔细阅读附带作业指导书，按照指导书要求进行操作。收到后如无法立刻开展实验，应按照指导书要求进行存放，避免待测目标物降解、失效，影响检测结果。检测前要对样品进行充分混匀，避免由样品不均造成结果重现性差。

2.4.2 标准曲线优化

通过预实验，粗略计算能力验证考核样品浓度。考虑加标及质控样浓度的前提下，尽量围绕样品的测定值设置标准曲线点，且尽量使其浓度值在标准曲线的中段，同时标准曲线的线性范围不可太宽，避免过低和过高浓度点检测数据偏离对标准曲线线性的影响。

2.4.3 实验操作

（1）人员。本试验操作过程较复杂，对试验人员熟练程度和经验要求较高。笔者在日常实验时曾发现，含呕吐毒素样品洗脱后若未及时氮吹，上机后样品测定结果及回收率均明显偏低。因此，试验过程应一气呵成，各操作步骤间避免长时间暂停。

（2）免疫亲和柱。待测液通过免疫亲和柱净化前，应使柱内原有液体通过全部柱体后流出且使柱体内无气泡，必要时可轻弹柱体加速气泡冒出，保证后续待测目标物通过净化柱时被充分保留，减少损耗；使用免疫亲和柱时，注意控制样品流速，流速过快，免疫亲和柱易吸附不完全，造成回收率不稳定，流速过慢，免疫亲和柱可能会吸附过多杂质，影响实验结果。

（3）氮吹。试验中应严格监控氮吹温度和速度，样品被吹至近干后立即拿出并复溶上机检测，过高、过快、过度氮吹，都会加大待测目标物损耗，影响结果准确度；为防止交叉污染，应提前清洗氮吹针外壁，使用后，需对氮吹针再次进行清洗。

（4）针孔滤膜。当前市场中微孔滤膜品牌众多，不同品牌微孔滤膜材质、过滤原理、使用对象大不相同。GB 5009.111—2016 标准中采用0.45 水相微孔滤膜，最终定容溶剂为20%甲醇水溶液，但部分品牌生产的水相微孔滤膜只适用于过滤纯水溶剂，过滤含有机相溶剂时会造成滤膜溶膜而无法达到过滤要求。故实验人员在使用前应注意其滤膜材质与样品最终定容溶剂是否相适用，确认滤膜无吸附和溶解现象后，方可使用。

3 结语

本次实验采用高效液相色谱法对2 份小麦粉能力验证考核样品进行测定，通过熟悉标准、准备实验耗材、预实验、标准曲线优化、质控样比对测定、能力验证样品测定等步骤，得到测定结果数据，最终顺利通过能力验证考核。

通过参与本次能力验证考核，能较好地处理实验过程中遇到的问题并进行归纳总结，提升检测操作能力与水平，强化检测结果的质量控制，使实验室在呕吐毒素检测能力方面迈上新台阶。