高效液相色谱仪测定蔬菜中4 种氨基甲酸酯类农药残留

◎ 李然然

（河南国康检测技术有限公司，河南 郑州 450000）

氨基甲酸酯类的农药属于高效且低毒的广谱杀虫剂，在我国被广泛用于农作物的病虫害防治方面，如谷物、蔬菜以及水果等。此类农药过量使用会产生环境污染，从而对人体健康产生危害[1]。氨基甲酸酯类农药在碱性的条件下水解生成具有荧光特点的甲胺物质，可利用液相色谱法来实现目标的分析且衍生化操作，利用荧光检测器对其进行检测。

1 实验一

1.1 检测仪器与试剂准备

本文中主要使用美国 Agilent 公司的1100 LC ，美瑞泰克公司的Pinnacle PCX 柱后衍生仪来进行检测，其中，试剂为色谱纯的乙腈、甲醇、二氯甲烷。氨基固相萃取柱主要使用迪马科技ProElut NH2500 mg/6 mL 进行提取。

本文标准样品以及溶液的配置，需要使用4种氨基甲酸酯类农药的标准品各1 mL，浓度为100 μg·mL-1。甲醇稀释到10 μg·mL-1备用。在样品制备过程中，需要称取蔬菜样品25.00 g，精确度要达到0.01 g，将其放置在150 mL 的烧杯内，加入50 mL的乙腈之后保持匀浆机匀浆5 min，经过滤纸过滤之后加入68 mL 的NaCl 具塞比色管中，充分振荡操作之后，等待静止，静止之后产生的分层可以吸取10 mL 放置于烧杯内，在80 ℃的水浴上进行浓缩操作的同时还需要吹入氮气，在接近干涸的时候取出，利用甲醇+二氯甲烷混合液（1+99）做淋洗液，将烧杯分3 次洗涤，将洗涤液加入氨基小柱，将其收集到淋浴液当中，放置在50 ℃的水浴当中，保持浓缩到近干的状态，其中的残渣可以利用2 mL 的甲醇溶液来稀释，经过0.45 μm 的过滤膜进行过滤，作备用[2]。

在该实验的液相色谱条件分析的过程中，C18色谱柱的流动相为甲醇和纯水，梯度洗脱的时间保持在0～9 min 的范围内，甲醇的比例为25%，处于9～10 min 范围内的甲醇比例为45%，10～25 min 范围内的甲醇比例为80%，保持1 min，在26 min 后回到初始状态。流速0.8 mL·min-1，柱温30 ℃；进样量10 mL。利用荧光检测器进行检测的时候，激发的波长为330 nm，发射波长为456 nm。4 种农药的线性方程、相关系数及出峰时间见表1。

表1 4 种农药的线性方程、相关系数及出峰时间表

测定过程对农药保留时间的定性操作，指标需要以色谱峰面积作为定量指标来进行分析，计算的时候可以利用外标法对蔬菜中的农药残留量进行分析和计算，如表2。

表2 4 种农药的浓度加标回收率测定表

1.2 计算结果

对于4 种农药而言，灭多威、涕灭威砜、异丙威、三羟基克百威经过线性方程计算之后，其中产生的出峰时间分别为16.215、12.519、25.799、19.616，在计算中采用的系数分别为0.999 76、0.999 76、0.999 80、0.999 8。其平均相关性数值为0.999 79，评价的回收率范围在80.70%～118.73%的范围内，满足检测要求且具备快速准确的优点。

2 实验二

2.1 实验试剂材料以及实验方式

本次实验对普通板栗进行分析，其中样品重量约为2 kg。试验中使用美国Thermo Fisher 色谱纯乙腈、美国Thermo Fisher 色谱纯甲醇、二氯甲烷、氯化钠、固相萃取柱氨基柱、有机滤膜几种物质，还需使用柱后衍生试剂来完成，其中含邻苯二甲醛、巯基乙醇、0.05 mol·L-1NaOH 溶液和OPA（邻苯二甲醛）稀释液，标准物质溶液中含涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、速灭威、克百威、甲萘威、异丙威和仲丁威这几种物质[3]。仪器设备采用Waters 高效液相色谱仪e2695 和荧光检测器以及柱后衍生系统对其进行分析研究，3.9×150 mm 色谱柱，1.5 mL·min-1流速，20 μL 进样量，荧光检测器λex339 nm，λem445 nm。

该实验柱后衍生条件：0.05 mol·L-1NaOH，流速0.3 mL·min-1；OPA 试剂，流速0.3 mL·min-1；反应池温度80 ℃。实验中，样品的制备和提取利用四分法，充分摇匀之后放入食品加工粉碎机作为待测样品。同样方式称取25 g 样品放入250 mL 的烧杯中，加入50 mL乙腈之后保持2 min 高度匀浆操作，定性滤纸过滤，产生的滤液在装有5～7 g 的NaCl 具塞量筒当中进行混合后盖上塞子进行膜封，经过2 min 的剧烈振捣摇匀，达到室内温度下静置分层1 h，等待净化操作。具体净化操作步骤：从具塞量筒当中利用移液器吸取10 mL乙腈相提取液，将其放置于200 mL 的烧杯内且保持在60 ℃的水浴锅内加热操作，蒸发，对蒸发后的干物质加入2 mL 的甲醇和二氯甲烷，将残渣进行溶解，完成净化操作。氨基柱的活化过程：用6 mL 甲醇+二氯甲烷混合液（1+99）做淋洗液来完成，分为三次洗涤烧杯，洗涤液内需要加入氨基小柱，洗脱溶液用25 mL的试管进行收集，用2 mL 的甲醇和二氯甲烷组成的混合液洗涤，在恒温50 ℃水的基础上，利用氮吹蒸发的方式使其接近干燥状态，保持1 min 的涡旋混匀，过0.45 μm 有机滤膜之后就可以对其进行测试。

2.2 实验结果与分析

在对色谱条件进行优化要从多个角度多个方面来实现。首先，在选择标品溶剂时，最终产生的目标峰值会受标品溶剂因素的影响，标品溶剂不同，对产生的峰面积以及峰形都会产生直接的影响[4]。也就是说，在混标的方式下进行进样操作时，丙酮最终的数值就会非常高，再加上之前的叠加效应，会形成很低的标品峰压缩状态数值，再加上对标品溶剂进行氮吹操作之后，进行混标的配置，其中标品峰呈现清晰美观的状态。如果溶解试剂为甲醇，则在试验当中可以发现前3 个峰拖尾属于平头峰，响应数值也相对较低，在利用近似于流动相起始比例的甲醇+水进行混标进样操作的时候，会发现峰形尖锐，对应产生的所有峰形相应值也较高。

其次，对样品的前处理优化操作，要按照相关的规定进行处理，依据《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定》（NY/T 761—2008）中第三部分前处理部分进行操作时，如果在封口膜的时候产生了剧烈震荡现象，则要预防提取液漏出问题。另外，需要对静止时间内产生的氨基柱的活化体积进行分析和计算，借助甲醇和二氯甲烷和体积的方式可以实现增加洗脱的作用，利用此种方式来进行增加甲醇比例，可以对氨基甲酸酯农药自身具备的洗脱能力进行不断加强[5]。

最后，对于定容溶液，根据相似相容的原理，在《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定》（NY/T 761—2008）第三部分中规定的甲醇定容方式来进行分析，和前三个峰一致也出现了拖尾现象。因此，利用甲醇+水2.5 mL 的定容进样出现了峰形尖锐对称的现象。在柱后条件进行分析之后，利用80 ℃的反应器进行操作，等到反应完全结束之后，可以有效避免在100 ℃的情况下反应器内部出现气泡现象，避免对荧光检测器产生一定的影响。

3 结语

综上所述，此种检测方式对于氨基甲酸酯类农药的检测可以进行快速准确的检测，其检测的时间为30 min，平均呈现的相关性数值为0.999 79，平均的回收率在80.7%～118.73%之间，满足其对应的检测需求。因此，从数据分析中可以得出，此种方式的分离效果好且准确度较高，实际的操作过程也较为简便迅速，可以满足日常的氨基甲酸酯类农药检测的实际需求。在改变标准物质的稀释溶液、定容溶液、流动相溶剂梯度以及柱后衍生条件之后，可以实现快速分析且取得良好的分离效果，在灵敏度和准确度方面都相对较高。