人参皂苷Rg3对大鼠实验性脉络膜新生血管的影响及作用机制研究

褚文丽，亢泽峰，李书娇，侯昕玥，陈水龄

脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是眼内新生血管的一种常见表现形式，指来自脉络膜毛细血管的新生血管病理性增生并穿过Bruch 膜向内发展，进入视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）层，或视网膜感觉神经层与RPE 层之间[1]。CNV 是湿性年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）的主要病理改变，因其血管通透性高，易引起黄斑部反复出血、渗出、瘢痕形成，从而导致中心视力严重下降，甚至失明[2]。CNV 的发生发展是多细胞、多信号通路协同参与的复杂过程，其中低氧环境诱发的缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor，HIF-1α）相关信号通路的级联反应，是最终导致CNV 形成的核心通路之一[3]。中药单体人参皂苷Rg3 具有抗新生血管的药理作用，近年被应用于眼部新生血管性疾病的研究[4]。本研究通过532 nm 激光诱导建立大鼠CNV 模型，予以人参皂苷Rg3 干预，观察其对实验性CNV进展的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

7～8 周龄雄性SPF 级BN 大鼠36 只（36 只眼），体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2021-0006]，饲养于中国中医科学院眼科医院动物房，维持（25±2）℃恒温，自由进食饮水。本研究实验动物及实验所用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定。

1.2 药品、试剂与仪器

参一胶囊（吉林亚泰制药股份有限公司，国药准字Z20030044，110804-201504），康柏西普眼用注射液（成都康弘药业集团股份有限公司，S20130012），兔抗血管内皮生长因子（vascular endothelium growth factor，VEGF）抗体、兔抗HIF-1α抗体（美国Abcam 公司，1316、2185），cDNA 第一链合成试剂盒（美国Thermo Scientific 公司，K1622）。532 nm 倍频Nd YAG 激光治疗机（德国LuMenis 公司，Novus Spectra），共聚焦激光眼底血管造影仪（德国Heidelberg公司，HRA2-TSP-00666），微量注射器（瑞士Hamilton 公司，1700），全自动荧光定量PCR仪（美国ABI公司，7500）。

1.3 激光光凝建立大鼠CNV模型

大鼠均选右眼为实验眼，在裂隙灯下用532 nm倍频Nd YAG激光治疗机围绕视盘并在距视盘1.5～2.0 视盘直径（papillary diameter，PD）位置等距离光凝10个点，激光光凝参数：波长532 nm，功率300 mW，光斑直径50 μm，爆破时间为0.05 s，当看到有气泡产生时，提示Bruch膜被击穿，作为有效点。

1.4 分组与给药

参一胶囊由人参皂苷Rg3 单一活性成分组成，故将参一胶囊内容物粉末溶于蒸馏水中配置人参皂苷Rg3药液。按照临床等效剂量计算，配置3.65、7.20、14.40 mg/kg3 个剂量，灌胃前加热至适温，以4 ℃保存。

将造模成功的30 只大鼠随机分为5 组，包括模型组（model group，MG）、人参皂苷Rg3低剂量组（LRg3）、人参皂苷Rg3 中剂量组（M-Rg3）、人参皂苷Rg3 高剂量组（H-Rg3）、阳性对照药康柏西普组（conbercept group，CB），另将未做任何处理的大鼠设为对照组（control group，CG），每组6 只。L-Rg3、M-Rg3、H-Rg3 组分别予3.65、7.20、14.40 mg/kg 的低、中、高人参皂苷Rg3 药液灌胃，每次灌胃量为2 mL，每日1 次；CB 组予玻璃体腔注射康柏西普注射液5 μL，共计1 次；CG、MG 组大鼠灌胃2 mL 蒸馏水，每日1 次。各组均干预7 d 后进行实验眼的观察。

CB组大鼠玻璃体腔注射方法：聚维酮碘液于大鼠结膜囊内点眼，0.9%氯化钠注射液冲洗，使用胰岛素针距角巩膜缘后约2 mm 处垂直穿刺巩膜进入，随后拔出换10 μL 微量进样器，与眼轴成45°方向朝视盘方向刺入玻璃体腔约2 mm，缓慢推注5 μL康柏西普注射液，留针片刻拨出，涂抹氧氟沙星眼膏预防感染。

1.5 FFA观察眼底情况

大鼠麻醉后，实验眼使用复方托品酰胺滴眼液充分散瞳，进行红外眼底成像，将10%荧光素钠注射液以120 mg/kg的剂量腹腔注射，观察荧光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）晚期（＞5 min）CNV 荧光素渗漏情况。取FFA 晚期像计算CNV 生成率（CNV 生成率=荧光渗漏激光斑数/激光斑总数×100%），用Image-Pro Plus 6.0软件分析计算渗漏激光斑的荧光素渗漏平均光密度（mean density，MD）值，评价CNV的发展和渗漏程度。

1.6 RT-qPCR 法检测HIF-1α、VEGF mRNA 表达水平

麻醉处死大鼠后，分离获取大鼠脉络膜组织，裂解组织提取总RNA，按照试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，进行实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）。反应体系：2×SYRB Green Mix 10 μL+上游引物1 μL+下游引物1 μL，cDNA 1 μL，超纯水补齐至20 μL；反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 °C 延伸30 s，循环39 次。采用2-△△Ct的方法进行计算各目的基因蛋白的相对表达强度，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参蛋白进行对照。引物设计与构建由北京睿博兴科生物技术有限公司完成（表1）。

表1 RT-qPCR实验相关引物信息

1.7 Western Blot法检测HIF-1α、VEGF蛋白表达

处死大鼠后，分离获取大鼠脉络膜组织，提取总蛋白，按照蛋白定量试剂盒操作测定总蛋白浓度，进行蛋白定量，依次经凝胶、电泳、转膜、封闭后，分别将兔抗HIF-1α抗体（稀释比例1∶1,000）、兔抗VEGF抗体（稀释比例1∶1,000）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（稀释比例1∶1,000）在4 ℃摇床上孵育过夜。次日洗膜后，按照羊抗兔二抗（稀释比例1∶4,000）室温孵育1 h。显影后使用Image-Pro Plus 6.0 软件对图像进行灰度分析，测定条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白表达量/同一样本内参蛋白表达量。

1.8 统计学方法

使用SPSS 25.0统计分析，符合正态分布和方差齐性的计量资料，以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例（%）表示，采用χ2检验。当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂苷Rg3对CNV大鼠眼底情况的影响

CG组大鼠视网膜血管荧光素钠充盈良好，视网膜血管以视盘为中心呈放射状分布，脉络膜血管呈网状分布，未见荧光渗漏。其余各组光凝后早期可见光斑区呈网状强荧光，晚期可见圆盘状荧光轻度渗漏，边界不清（图1）。

MG 组大鼠CNV 生成率达66.70%，L-Rg3、MRg3、H-Rg3 组依次为63.30%、60.00%、56.70%，CB组为56.70%，差异无统计学意义（P＞0.05）。6 组间大鼠荧光素渗漏MD值比较，差异有统计学意义（F=83.940，P=0.000）。两两比较，与CG 组比较，MG 组MD 值升高（t=17.846，P=0.000）；与MG 组比较，MRg3、H-Rg3、CB 组MD 值降低（tM-Rg3=5.032，tH-Rg3=6.593，tCB=9.618，均P=0.000）；与H-Rg3 组比较，CB组MD 值升高（t=3.025，P=0.011），差异均有统计学意义（表2）。

2.2 人参皂苷Rg3 对CNV 大鼠脉络膜HIF-1α、VEGF mRNA表达的影响

6 组大鼠脉络膜HIF-1α mRNA 表达比较，差异有统计学意义（F=80.480，P=0.000）。两两比较，与CG 组比较，MG 组HIF-1α mRNA 表达升高（t=16.280，P=0.000）；与MG组比较，M-Rg3、H-Rg3、CB组HIF-1α mRNA 表达降低（tM-Rg3=8.692，tH-Rg3=12.070，tCB=14.510，均P=0.000）；与CB 组比较，HRg3 组HIF-1α mRNA 表达升高（t=2.431，P=0.031），差异均有统计学意义（表2）。

表2 各组大鼠脉络膜HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表达（±s，n=3）

表2 各组大鼠脉络膜HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表达（±s，n=3）

注：* 与CG 组比较，P＜0.05；# 与MG 组比较，P＜0.05；△ 与H-Rg3 组比较，P＜0.05；CG 对照组；MG 模型组；L-Rg3 人参皂苷Rg3 低剂量组；M-Rg3 人参皂苷Rg3 中剂量组；H-Rg3 人参皂苷Rg3 高剂量组；CB 康柏西普组；CNV 脉络膜新生血管；HIF-1α 缺氧诱导因子-1α；VEGF血管内皮生长因子

组别CG MG L-Rg3 M-Rg3 H-Rg3 CB F值P值mRNA 蛋白VEGF 0.12±0.03 0.92±0.03*0.94±0.04 0.68±0.06#0.52±0.03#0.36±0.10＃△104.220 0.000 HIF-1α 1.00±0.00 2.79±0.24*2.38±0.11 1.83±0.12#1.46±0.05#1.19±0.15#△80.480 0.000 VEGF 1.00±0.00 3.65±0.27*3.22±0.30 2.42±0.30#1.81±0.21#1.21±0.06#△69.000 0.000 HIF-1α 0.07±0.06 0.91±0.08*0.87±0.10 0.59±0.03#0.39±0.04#0.39±0.09＃△61.290 0.000

6组大鼠脉络膜VEGF mRNA 表达比较，差异有统计学意义（F=69.000，P=0.000）。两两比较，与CG组比较，MG 组VEGF mRNA 表达升高（t=14.500，P=0.000）；与MG 组比较，M-Rg3、H-Rg3、CB 组VEGF mRNA 表达降低（tM-Rg3=6.730，tH-Rg3=10.068，tCB=13.351，均P=0.000）；与CB 组比较，H-Rg3 组HIF-1α mRNA 表达升高（t=3.283，P=0.007），差异均有统计学意义（表2）。

2.3 人参皂苷Rg3 对CNV 大鼠脉络膜HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响

6 组大鼠脉络膜HIF-1α 蛋白表达比较，差异有统计学意义（F=60.486，P=0.000）。两两比较，与CG组比较，MG 组HIF-1α 蛋白表达升高（t=14.406，P=0.000）；与MG 组比较，M-Rg3、H-Rg3、CB 组HIF-1α 蛋白表达降低（tM-Rg3=5.488，tH-Rg3=8.918，tCB=8.918，均P=0.000）；与CB 组比较，H-Rg3 组HIF-1α蛋白表达比较（P＞0.05），差异无统计学意义（表2、图2）。

图2 各组大鼠脉络膜HIF-1α、VEGF蛋白的表达

6组大鼠脉络膜VEGF蛋白表达比较，差异有统计学意义（F=104.220，P=0.000）。两两比较，与CG组比较，MG 组VEGF 蛋白表达升高（t=17.938，P=0.000）；与MG 组比较，M-Rg3、H-Rg3、CB 组VEGF蛋白表达降低（tM-Rg3=5.382，tH-Rg3=8.969，tCB=12.557，均P=0.000）；与CB 组比较，H-Rg3 组VEGF 蛋白表达升高（t=3.588，P=0.004），差异均有统计学意义（表2、图2）。

3 讨论

AMD 是工业化国家65 岁以上人群视力丧失的主要原因之一，是一种涉及遗传、环境、年龄等多种危险因素相互作用的复杂慢性疾病[5]。临床上AMD主要分为干性（或称萎缩性、非新生血管性）和湿性（或称渗出性、新生血管性）两型，干性AMD 主要以视力缓慢下降、后极部出现玻璃膜疣、黄斑区色素上皮增生、甚至出现地图样萎缩为主要表现；湿性AMD 则以视力减退较为迅速、黄斑区CNV 生长、病灶区出血、后期机化形成灰白样瘢痕病灶为典型表现，是造成90%以上AMD 患者视力丧失的原因[6]。亢泽峰[7-8]在中医理论指导下，结合多年临床经验，将湿性AMD归属于“瞳神络病”范畴，提出其基础病因为“目络不通”，核心病机为“络虚不荣”，以“调气血、护气阴、通目络”治则指导临床，研究[9]证实取得良好的效果。CNV 的病变在络，与经络脏腑的虚衰密切相关[10]，肾精亏虚，气血不足，本虚标实，因气累血，因虚致瘀，由虚致虚实夹杂。治疗上“急则治其标”以开滞导郁泻余为主，“缓则治其本”则以益气养血为要，络虚通补，或加以活血理气，或辛味通络。总之，益气扶正治法应贯穿治疗湿性AMD的全过程。

玻璃体腔反复注射VEGF 抑制剂是目前治疗新生血管性AMD 的主要方法，其通过直接结合VEGF受体或游离的VEGF 分子发挥作用，从而降低血管通透性和新生血管增殖[11-12]。但注射频率高、部分患者对药物应答较慢甚至不应答、产生药物耐受等问题，导致抗VEGF治疗仍面临多重挑战[13-14]。中医药治疗AMD 具有悠久的历史，在改善患者视功能、降低患者复发率及改善患者的全身症状方面具有一定的优势。人参属五加科草本植物，药性甘、微苦，归肺、脾、心经，具有大补元气、补脾益肺、生津、安神益智的功效[15]。人参含有皂苷、多糖、氨基酸、脂肪酸等多种化学成分，其中皂苷是人参各种药理作用和生物活性的主要活性成分，目前已确定结构的人参单体皂苷达50 余种[16]。人参皂苷Rg3 属四环三萜皂苷，分子式为C42H72O13，是人参抗肿瘤的活性成分，以其为单一活性成分的参一胶囊是我国批准上市的第一个抗肿瘤新生血管抑制剂。现代研究[17]证实，人参皂苷Rg3具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化与凋亡、抑制肿瘤血管生成以及增强机体免疫力等作用，对肺癌、大肠癌、前列腺癌等均有一定抑制作用。近年来，还有研究[18-19]证实，人参皂苷Rg3 应用于抗眼部新生血管方面能够抑制CNV的生成。

目前在CNV 发病机制及其防治策略研究中，VEGF 是研究最多的促血管生成因子，而缺氧是诱导VEGF 过度表达的重要因素。低氧环境诱导HIF-1α 等因子表达，过度表达的HIF-1α 进入细胞核，HIF-1β与HIF-1α相结合形成HIF-1转录因子，结合VEGF 基因的3´端和5´端，诱导VEGF 的表达，促进血管内皮细胞的增殖、迁移，从而促使新生血管形成。本研究鉴于缺氧等因素在CNV 形成过程中重要作用，初步探索人参皂苷Rg3 对激光诱导的大鼠CNV 进展的干预作用，并探讨其作用机制。通过532 nm激光诱导建立大鼠CNV模型，给予中药单体人参皂苷Rg3不同剂量灌胃治疗7 d，并设康柏西普玻璃体腔注药组为阳性对照，观察其对大鼠CNV模型的影响。通过FFA 结果显示M-Rg3、H-Rg3 组光斑荧光渗漏强度均低于MG、L-Rg3 组，说明人参皂苷Rg3 具有抑制实验性CNV 形成的作用。通过检测各组视网膜脉络膜复合组织中HIF-1α 和VEGF的相对表达量，结果显示L-Rg3组与MD 组差异无统计学意义，M-Rg3、H-Rg3 组较MG 组显著减少，但高于CB 组，说明人参皂苷Rg3 抑制大鼠CNV的形成，需要达到一定的灌胃剂量，即7.20 mg/kg，且在短期内CB 组优于人参皂苷Rg3 组。临床上玻璃体腔注射康柏西普具有作用时间短、需要反复给药、价格昂贵等局限性，因此积极探索人参皂苷Rg3有可能作为有效抑制CNV 的潜在药物，与抗VEGF治疗联合应用，或者单独用药，对CNV 的治疗具有重要的意义。

综上所述，本研究发现在CNV 生成早期，人参皂苷Rg3 能够抑制大鼠实验性CNV 荧光素渗漏，从而延缓CNV 的发生发展，其作用机制可能与下调HIF-1α、VEGF 蛋白表达，抑制HIF-1α 信号通路的激活有关，但其临床有效性和安全性有待进一步研究。