干细胞外囊泡：一种有前途的骨质疏松症替代疗法

傅德皓 汪泱 车奔驰

一、骨质疏松症的研究现状及进展

随着社会发展和平均预期寿命延长，骨质疏松症 (osteoporosis，OP)已成为当今社会最常见的慢性疾病之一。OP 是一种全身性骨病，特征主要为骨结构强度减弱、骨量减少和骨折风险增加。由于其极高的发病率和致残率，给社会带来沉重的公共卫生负担。多项研究表明，OP 会对骨折愈合产生不利影响，导致骨折延迟愈合。因此，有效防治 OP 不仅可预防骨折风险，还可缩短骨折愈合的时间并提升愈合质量。

目前，治疗 OP 药物主要分为抗吸收、促成骨和同时具备双重药理作用的药物，但这些药物仍存在不良反应，而且治疗效果欠佳。细胞外囊泡 (extracellular vesicles，EVs)是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡统称，囊泡中包含蛋白质、脂质和核酸等物质。EVs 可以根据其直径分成凋亡小体、微泡和外泌体。外泌体的直径为 30～150 nm，微泡的直径为100～1000 nm，凋亡小体的直径约为 50～5000 nm。EVs 在多种生物学过程中发挥重要作用，包括细胞间通信、凋亡、免疫反应和肿瘤发生发展等。干细胞 (stem cells，SCs)是一种具有自我更新、多向分化潜能的细胞，根据其分化潜能也可分为全能干细胞、多能干细胞 (pluripotent stem cell，PSC)与专能干细胞。多能干细胞拥有能分化为几乎所有细胞类型的能力，如胚胎干细胞 (embryonic stem cell，ESC)与。而专能干细胞也称单能、偏能干细胞，此类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如间充质干细胞 (mesenchymal stem cell，MSC)等，MSC 可从骨髓、脂肪、脐带等部位获得，其细胞发育潜能较多能干细胞较低。随着科学的发展，目前出现的人工诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells，iPSC)同样属于多能干细胞层次，是从人体分化成熟的功能细胞 (如皮肤细胞和血液细胞)通过基因转染使其逆转为原始的干细胞，分化潜能极高。SCs 也根据其多能性成为发挥治疗作用的基础，即在特定条件下具有向成骨细胞分化的能力，有益于诱导骨形成。不同 SCs 来源的 EVs (SCs-EVs)生物学特征、功能与 SCs 类似，拥有组织修复、诱导成骨、促进血管新生和骨矿化聚集等作用，在 OP 的治疗方面展现出良好的应用前景。

二、SCs-EVs 治疗 OP 的研究进展

骨组织是一种代谢高度活跃的组织，处于不断的破坏、吸收、新生的动态平衡中。随着年龄的增长，当骨吸收大于骨形成时，这种动态平衡失调就会导致 OP。而这种骨的重塑过程主要由破骨细胞和成骨细胞参与，骨细胞、内皮细胞、单核细胞、造血干细胞、间充质干细胞及其它细胞参与调控过程。上述各类细胞间相互影响、相互调节，进而维持骨稳态。EVs 携带蛋白质、聚糖、脂质、DNA、RNA 等生物分子，其被其它细胞吸收时，这些生物分子被转移并影响受体细胞的表型，从而发挥效应。近年来多项研究发现多种SCs-EVs 在维持骨稳态、防治 OP 方面发挥了重要作用。

MSC 由于种类繁多、来源广泛，再加之其不错的分化潜能，在 SCs-EVs 治疗 OP 的研究中一直占据重要地位，而骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作为最直接与成骨分化相关的SCs，其来源的 EVs 研究热度一直居高不下。Zuo 等[1]研究发现 BMSCs-EVs 可以减轻辐射诱导的大鼠骨丢失，机制可能与减轻氧化应激反应、加速 DNA 损伤修复、减少与抑制增殖和细胞衰老相关的蛋白以及通过激活 Wnt / βcatenin 通路相关。Yang 等[2]研究表明，BMSCs-EVs 通过 MALAT1 介导 miR-34c / SATB2 轴增强了骨质疏松小鼠的成骨细胞活性，可减轻骨丢失。Aya S. Sedik 等[3]构建了一种糖皮质激素致骨质疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)的小鼠模型，观察到 BMSCs-EVs 使 GIOP 大鼠牙槽骨恢复了规则的轮廓，证明 EVs 对 GIOP 具有一定治疗效果。

有关其它 MSCs-EVs 的研究，近些年来也多有发表。Lee 等[4]分离来自脂肪干细胞的 EVs (extracellular vesicles from adipose stem cells，ASC-EVs )，这种 EV 富含与骨代谢和 MSCs 迁移相关的生长因子和细胞因子，促进骨髓源性 MSCs 的迁移，可减轻 OP 模型小鼠的骨丢失。此外，miR-21-5p 通过下调 Acvr2a 抑制破骨细胞分化，显著降低了破骨细胞相关基因的表达，提示 ASC-EVs 作为干细胞的无细胞疗法治疗骨质疏松策略非常有前景。人脐带间充质干细胞 (umbilical cord mesenchymal stromal cell，HUCMSC)来源的 EVs (UCMSC-EVs )在组织修复和再生方面也表现出了相当大的治疗作用，Yin 等[5]测定了 UCMSC-EVs 对 BMSCs 成骨和成脂分化的影响，结果表明其通过转移 CLEC11A 增强了 BMSC 从成脂到成骨分化的转变，这可能代表了一种治疗骨质疏松症的潜在疗法。由于从骨髓中获取 MSC 是一个痛苦和侵入性的过程，很多研究者试图寻找一种简单、安全、方便的新的干细胞来源方式。多项研究已经证实，人类尿液中含有丰富的干细胞，具有类似 MSC 的生物学特性。Chen 等[6]在 OP 小鼠模型中研究了尿液干细胞 (urine-derived stem cells，USCs)来源的 EVs 对骨形成和强度的影响，并评估了 USC-EVs 对成骨活性和破骨细胞形成的影响，证明其增强成骨活性并抑制破骨细胞形成，最终恢复 OP 模型小鼠的骨量和骨骼强度。

MSCs 对骨缺损的愈合具有较大的益处，但自体原代 MSC 可能伴有并发症，且自体 MSC 的体外分化和增殖潜力会随年龄增长而降低，临床应用受到限制。诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells，iPSC)衍生的 MSC (iMSC)结合了 MSC 和 iPSCs 的优越性，具有强大的自我更新能力，iPSCs 可以产生无数个 iMSC，并且避免了常规 MSC 所需的侵入性获取过程和干性随着衰老或细胞传代而下降的问题。此外，自体 iPSC 来源的细胞或其 EVs 用于治疗不会引起免疫排斥反应，可能更有利于临床转化。Fu 等[7]研究获取了 iMSCs 的EVs，其携带抗骨质疏松功能的 miRNA 谱，还可增强成骨分化，抑制破骨细胞形成，从而提示 iMSCs 的 EVs可能是一种可行且高效的的干细胞的无细胞治疗骨质疏松症疗法。Wang 等[8]通过研究 iPSC-MSC-EVs 对卵巢切除大鼠 BMSCs 的影响，发现可有效刺激 BMSCs 的增殖和成骨分化，并且这种作用随着 EVs 浓度的增加而增加。Fu 等[9]对人诱导多能干细胞来源的内皮细胞 (iPSCs-ECs)进行连续挤出而获得 EVs，由于骨髓血管内皮细胞 (bone marrow vascular endothelial cells，BMECs)对骨髓微环境的稳态调节发挥着非常重要的功能，故BMECs 摄取了这些 EVs 后，能够产生更多的细胞因子，促进了 BMSC 的成骨分化，抑制其成脂分化，还纠正了骨质疏松微环境中的骨 - 脂分化失衡和 M1-M2 极化失衡。作为多能干细胞家族的一员的胚胎干细胞由于其优秀的分化潜能也受到了相当多的关注，Wang 等[10]使用人胚胎干细胞来源的 EVs [ human embryonic stem cell-derived small extracellular vesicles (hESC-sEVs)] 来恢复衰老 BMSCs 的功能，结果提示 hESC-sEVs 在逆转BMSCs 衰老以及衰老导致的成骨功能障碍中的作用极为显著，证明其可能是治疗衰老性疾病的候选疗法。

三、SCs-EVs 治疗 OP 的展望

近年来的研究表明，SCs-EVs 在 OP 的防治中表现出良好的应用前景，来源于各类 MSCs 如 BMSC、ASC、UCMSC 及 USC 等的 EVs 均体现出其不俗的治疗效果。但不可忽略的是，上述 SCs 来源的 EVs 仍存在许多问题及缺陷，临床转化及成药性十分困难。如 BMSCs-EVs，虽然与成骨分化直接相关，但其有创性的侵入性获取方法不但应用不便，而且带给患者极大的痛苦。ASC-EVs 虽然来源广，但也存在来源不稳定等问题，来源不同的 ASC 可能导致治疗效果不稳定。而 USC-EVs 虽然听起来只需患者收集一定量的自身尿液来制备，但这种针对每个个体的治疗策略在临床转化时很难实现，成药性更是比较渺茫。相对来说，UCMSC-EVs在各类 MSC 中优势比较明显，其取材方便、增值力也较强、且无排斥等问题，但也存在来源相对有限和稳定性问题。相比之下，iPSCs 的来源相对更广，并且避免了常规 MSC 的侵入性获取过程和干性随着衰老或细胞传代而下降的问题，还具有相对 MSC 更高的分化潜能及稳定性，可能更有利于临床转化。总体来讲，iPSCs-EVs 在 OP 的治疗中拥有更加光明的前景，也给人们带来了更大的期待。