燕麦麸皮枯草芽孢杆菌固态发酵工艺优化

张倩芳，李 敏，栗红瑜，孟晶岩

（山西功能食品研究院，山西 太原 030031）

燕麦，禾本科一年生作物，主要种植于北方冷凉地区，是一种公认的全营养谷物[1]。燕麦不仅含有丰富的膳食纤维、必需氨基酸、不饱和氨基酸，其多酚类抗氧化物质含量也十分丰富[2-3]。燕麦的抗氧化活性近年来受到了越来越多的关注[4]。

固体发酵作为微生物发酵技术的一种，具有操作简便、酶系丰富、成本低、无污染等优点[5]。目前对燕麦的发酵研究主要集中于改善燕麦的风味特性及燕麦活性成分的释放方面[6-7]。采用枯草芽孢杆菌对燕麦麸皮进行固态发酵，分析不同发酵条件对燕麦麸皮多酚含量的影响，并通过正交试验找到最佳的发酵工艺，以期为燕麦麸皮抗氧化成分的开发和利用提供思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料和试剂

燕麦麸皮，山西华启顺食品科技有限责任公司提供；枯草芽孢杆菌，南京乐诊生物技术有限公司提供；PBS 缓冲液、ABTS 工作液，上海尚宝生物科技有限公司提供；福林酚、碳酸钠、没食子酸，均为分析纯。

1.2 仪器

CJ-1D 型净化工作台，北京中兴伟业世纪仪器有限公司产品；HY-08 型高速粉碎机，北京环亚天元机械技术有限公司产品；YX-18HDD 型蒸汽灭菌锅，江阴滨州医疗设备有限公司产品；303-3B 型恒温培养箱，天津市通利信达仪器厂产品；ZXY-48 型恒温摇床，常州润华电器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 活化菌种

以2%的接种量将枯草芽孢杆菌菌液接种于LB培养基中，于32 ℃下以转速100 r/min 培养24 h 获得活化的菌种。

1.3.2 燕麦麸皮发酵

燕麦麸皮粉碎后过60 目筛，称取20 g，高压蒸汽灭菌后，按试验所需料液比加入活化后的枯草芽孢杆菌混悬液，混合均匀，按试验设计所需温度、时间进行固体发酵，发酵完成后55 ℃下烘干，粉碎后保存备用。

1.3.3 单因素试验设计

（1） 发酵温度的优化。根据预试验，选择接种量为10%，发酵时间为5 d，料液比为1∶1.75，研究不同发酵温度（24，27，30，33，36 ℃） 对燕麦麸皮多酚含量的影响。

（2） 发酵时间的优化。选择接种量为10%，发酵温度为33 ℃，料液比为1∶1.75，研究不同发酵时间（2，3，4，5，6，7 d） 对燕麦麸皮多酚含量的影响。

（3） 料液比的优化。选择接种量为10%，发酵时间为5 d，发酵温度为33 ℃，研究不同料液比（1 ∶1.00，1 ∶1.25，1 ∶1.50，1 ∶1.75，1 ∶2.00，1∶2.25，1∶2.50） 对燕麦麸皮多酚含量的影响。

（4） 接种量的优化。选择发酵温度为33 ℃，发酵时间为5 d，料液比为1∶1.75，研究不同接种量（2.5%，5.0%，7.5%，10.0%，12.5%，15.0%，17.5%） 对燕麦麸皮多酚含量的影响。

1.3.4 正交试验设计

在单因素试验的基础上，选取最优的发酵条件，以燕麦麸皮多酚含量作为指标设计正交试验，研究燕麦麸皮发酵的最佳工艺。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.3.5 多酚的提取

称取发酵好的样品1.0 g，加入体积分数为70%的无水乙醇溶液100 mL，55 ℃水浴振荡提取2 h，以转速5 500 r/min 离心20 min，取上清液即为多酚提取液[8]。

1.3.6 多酚含量的测定

参考A F V D、聂攀等人[9-10]方法并加以改进，取多酚提取液1 mL，福林酚试剂0.5 mL，加入6 mL纯水中，混匀，反应6 min 后加入质量分数为7.5%的Na2CO3溶液5 mL，混匀，避光反应1 h 后于波长765 nm 处测定吸光度。以没食子酸为标准品，绘制的标准曲线方程式为：Y=0.087X+0.019（R2=0.999 7），以没食子酸当量（mg/g） 计算多酚含量，同时做空白对照。

1.3.7 ABTS 自由基清除率的测定

参考王广慧等人[11]的方法，称取发酵前后的样品1 g 溶于10 mL 纯水中，于55 ℃条件下振荡提取1 h，以转速5 500 r/min 离心20 min 得到上清液。取上清液1 mL，加入PBS 缓冲液1 mL，ABTS 工作液2 mL，室温下反应30 min，于波长734 nm 处测定吸光度A1。将ABTS 工作液替换为纯水，测定吸光度A2，将上清液替换为PBS 缓冲液，测定吸光度A0。

2 结果与分析

2.1 燕麦麸皮发酵单因素试验结果

2.1.1 发酵温度对燕麦麸皮多酚含量的影响

发酵温度对燕麦麸皮多酚含量的影响见图1。

图1 发酵温度对燕麦麸皮多酚含量的影响

由图1 可知，随着发酵温度的升高，燕麦麸皮多酚含量呈现先升高再降低的趋势，在33 ℃时多酚含量达到最大值。这是因为枯草芽孢杆菌的生长受温度影响较大，随着发酵温度的提高，菌株活性增强，代谢速率加快，多酚含量也逐渐增加，温度继续升高，菌株的生长受阻，酶活力降低，多酚含量下降。

2.1.2 发酵时间对燕麦麸皮多酚含量的影响

发酵时间对燕麦麸皮多酚含量的影响见图2。

图2 发酵时间对燕麦麸皮多酚含量的影响

由图2 可知，发酵初期枯草芽孢杆菌处于对数生长期，代谢旺盛，发酵产物逐渐积累，多酚含量逐渐升高，随着枯草芽孢杆菌生长进入稳定期，5 d时多酚含量达到最高，继续发酵，菌株进入衰亡期，代谢废物增加，多酚被分解利用，从而导致含量降低，故选择5 d 为最优发酵时间。

2.1.3 料液比对燕麦麸皮多酚含量的影响

料液比对燕麦麸皮多酚含量的影响见图3。

图3 料液比对燕麦麸皮多酚含量的影响

由图3 可知，当料液比低于1∶1.75 时，多酚含量与料液比呈正相关，料液比大于1∶1.75 时，随着料液比的增加，多酚含量缓慢下降，因此选择1∶1.75为燕麦麸皮发酵的最佳料液比。培养基中的水分含量直接影响菌株的生长，水分较低时，培养基黏度大，流动性差，枯草芽孢杆菌生长缓慢，水分含量过高，培养基通气性变差，菌株呼吸作用受到抑制，都影响多酚的积累。

2.1.4 接种量对燕麦麸皮多酚含量的影响

接种量对燕麦麸皮多酚含量的影响见图4。

图4 接种量对燕麦麸皮多酚含量的影响

由图4 可知，燕麦麸皮多酚含量随着接种量的增加呈现先增加后下降的趋势，在接种量为10%时达到最高值。接种量较低时，培养基营养充足，有利于菌体产酶，多酚逐渐积累，接种量大于10%时，培养基不足以提供菌体生长所需的营养物质，代谢废物增加，多酚的积累受到限制。

2.2 燕麦麸皮发酵工艺优化

燕麦麸皮正交试验结果见表2。

表2 燕麦麸皮正交试验结果

由表2 可知，影响发酵燕麦麸皮多酚含量的因素依次为发酵时间>发酵温度>料液比>接种量，最佳发酵工艺为A2B2C2D2，以最优的发酵工艺进行3 次发酵试验，得出燕麦麸皮的多酚含量为10.808 mg/g，因此燕麦麸皮发酵的最佳工艺为发酵温度30 ℃，发酵时间5 d，料液比1∶1.75，接种量10%，此时发酵麸皮的多酚含量达到最高。

2.3 发酵前后燕麦麸皮多酚含量和抗氧化活性检测

燕麦麸皮发酵前后多酚含量和抗氧化活性对比见表3。

表3 燕麦麸皮发酵前后多酚含量和抗氧化活性对比

发酵后，燕麦麸皮多酚含量达到10.81 mg/g，是未发酵麸皮的6.93 倍，同时抗氧化活性也大幅提高，ABTS 自由基清除率是未发酵麸皮的1.36 倍。表明枯草芽孢杆菌固态发酵对于燕麦麸皮多酚的释放和富集有明显作用，可以用于之后对燕麦麸皮多酚的研究中，但是具体的作用机制尚不明确，还需进一步研究。

3 结论

利用枯草芽孢杆菌对燕麦麸皮进行固态发酵，通过单因素试验及正交试验确定了燕麦麸皮发酵的最佳工艺为发酵温度30 ℃，发酵时间5 d，料液比1∶1.75，接种量10%。在此条件下，发酵后燕麦麸皮多酚含量为10.81 mg/g，ABTS 自由基清除率为95.21%，分别是未发酵麸皮的6.93 倍和1.36 倍，为燕麦麸皮多酚的高效利用提供了理论基础。