Tubastatin A通过降低氧化应激减轻脓毒症所致心肌损伤的体外研究

尤佳琪，刘畅，崇巍

（中国医科大学附属第一医院急诊科，沈阳 110001）

研究［1］显示，40%～50%脓毒症患者可发生心肌抑制，其中的7%会发生心力衰竭。目前，对于脓毒症所致心功能障碍的机制尚未明确，普遍认为心肌抑制与脓毒症时的炎症介质、线粒体功能障碍和氧化应激损伤等有关，但确切机制仍不清楚［2］。生理条件下，心脏组织中活性氧 （reactive oxygen species，ROS）生成很少［3］，然而在缺氧、高糖、炎症等刺激下ROS大量产生［3-6］。脓毒症时，循环中病原体相关分子模式 （pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）、损伤相关分子模式 （damage-associated molecular patterns，DAMPs） 共同作用于心肌细胞［7］，通过诱导胞内的黄嘌呤氧化酶 （xanthine oxidase，XO）、NADPH氧化酶 （NADPH oxidase，NOX） 活化和线粒体损伤产生ROS［8］。过量的ROS引起心肌细胞氧化应激损伤［9］。Tubstatin A （Tub A） 是组蛋白去乙酰化酶6 （histone deacetylase 6，HDAC6） 选择性抑制剂［10］，本课题组密歇根大学合作伙伴发现Tub A可以提高致死性脓毒症大鼠的远期生存率［11］。有研究［12-16］表明，Tub A可以减少心肌细胞、星形胶质细胞、乳腺上皮细胞等ROS的产生，减轻炎症反应，从而对细胞发挥保护作用。

本研究应用脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS） 刺激巨噬细胞获得细胞上清液，用其刺激心肌细胞，建立体外脓毒症心肌损伤模型，并用Tub A进行干预，探讨Tub A对脓毒症心肌细胞氧化应激损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及分组

RAW264.7巨噬细胞购自美国ATCC公司，培养条件为完全培养基 （DMEM高糖培养基+10%FBS+1%青链霉素），37 ℃，5% CO2以及饱和湿度孵箱。巨噬细胞生长达80%左右接触率时饥饿培养 （DMEM高糖培养基+0.5%FBS+1%青链霉素） 过夜，用1 μg/mL LPS （L8247，美国Sigma公司） 刺激8 h后取上清液获得心肌细胞培养基 （MCM组）；用无LPS刺激的巨噬细胞8 h后取上清液获得心肌细胞培养基 （Sham组），两种上清液4 ℃保存备用。

用完全培养基培养H9C2心肌细胞 （美国ATCC公司），培养条件与RAW264.7巨噬细胞一致。待H9C2生长达80%左右接触率并饥饿过夜后，Sham组用无LPS刺激的巨噬细胞上清液培养；MCM组用LPS刺激巨噬细胞所获上清液培养；Tub A组预处理 （饥饿培养基+40 μmol/L Tub A） 3 h，正式处理 （MCM组应用的培养基+40 μmol/L Tub A） 孵育24 h［17-18］，收集心肌细胞及上清液检测相关指标。

1.2 巨噬细胞上清液中一氧化氮 （nitric oxide，NO）水平检测

应用总NO含量检测试剂盒 （S0024，中国碧云天公司） 检测，操作按照说明书步骤进行。酶标仪 （美国Biotec公司） 测定样本在540 nm的吸光度值，根据标准曲线计算样品浓度。

1.3 心肌细胞活性检测

将Sham组、MCM组、Tub A组和空白对照组 （饥饿培养基培养的心肌细胞） 按照1×104/孔接种到96孔板并饥饿过夜后给予相应刺激。在各孔中加入10 μL的CCK8试剂 （日本同仁化工公司），混匀后放回孵箱，2 h后拿出96孔板，酶标仪测定样本在450 nm处的吸光度值。

1.4 流式细胞仪检测心肌细胞内ROS水平

收集各组心肌细胞制备细胞悬液，应用ROS检测试剂盒 （CA1410，中国索莱宝公司） 将DCFH-DA探针装载入心肌细胞内 （阴性对照除外），应用流式细胞仪检测荧光强度，用FITC通道检测2，7-二氯荧光素 （2，7-dichlorofluorescein，DCF） 荧光，应用Flow Jo软件分析结果。

1.5 心肌细胞内丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 含量检测

收集各组心肌细胞，检测MDA含量。按照试剂盒 （BC0025，中国索莱宝公司） 说明书步骤进行操作，检测心肌细胞内MDA含量，应用酶标仪测定样本在532 nm和600 nm处的吸光度值。各组分别计算：ΔA532=A532测定-A532空白，ΔA600=A600测定-A600空白，ΔA=ΔA532-ΔA600； MDA含量 （nmol/107cell） =107.5×ΔA。

1.6 细胞释放的乳酸脱氢酶 （lactate dehydrogenase，LDH） 检测

按照试剂盒 （BC0685，中国索莱宝公司） 说明书检测2组巨噬细胞上清液中以及各组心肌细胞上清液中的LDH，应用酶标仪测定样本在450 nm处的吸光度值，根据标准曲线计算样品浓度。心肌细胞所产生的LDH=LDH （心肌细胞上清液） -LDH （所用的巨噬细胞上清液）。

1.7 心肌细胞释放心肌型肌酸激酶同工酶 （creatine kinase-MB，CK-MB） 检测

收集各组心肌细胞上清液，按照试剂盒 （SEKR-0059，中国索莱宝公司） 说明书步骤检测CK-MB水平，应用酶标仪测定样本在450 nm、630 nm处的吸光度值，根据标准曲线计算样品浓度。巨噬细胞不产生CK-MB，因此心肌细胞上清液中的CK-MB是心肌细胞产生的。

1.8 统计学分析

应用Excel 2016录入数据，计量资料采用±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCM组和Sham组巨噬细胞上清液中NO水平

结果显示，MCM组和Sham组巨噬细胞上清液NO含量分别为 （16.27±3.57） μmol/L、 （0.90±0.68） μmol/L，2组比较差异有统计学意义 （P＜ 0.001）。

2.2 各组心肌细胞氧化应激水平比较

检测各组细胞ROS荧光强度，以阳性对照组荧光强度峰值为标准，测量各组大于该荧光强度的细胞占比。结果显示，阳性对照组、Sham组、MCM组、Tub A组、阴性对照组细胞占比分别为46.2%、22.9%、33.0%、22.5%和0。见图1A。对各组平均荧光强度进行定量分析，结果显示MCM组荧光强度显著高于Sham组和Tub A组 （均P＜ 0.05），而Sham组和Tub A组荧光强度比较无统计学差异 （P＞ 0.05），见图1B。与Sham组比较，MCM组心肌细胞中MDA含量显著增加 （P＜ 0.05）；与MCM组比较，Tub A组MDA含量显著减少 （P＜ 0.05）。见图1C。

图1 各组心肌细胞中ROS及MDA水平比较Fig.1 Comparison of ROS and MDA levels in each group

2.3 各组心肌细胞损伤情况比较

与Sham组比较，MCM组心肌细胞释放的LDH水平明显升高 （P＜ 0.05）；与MCM组比较，Tub A组LDH水平明显下降 （P＜ 0.05），见图2A。与Sham组比较，MCM组CK-MB水平明显升高 （P＜ 0.05），与MCM组比较，Tub A组CK-MB水平有下降趋势，但差异无统计学意义 （P＞ 0.05），见图2B。

图2 各组心肌细胞损伤情况比较Fig.2 Comparison of myocardial cell injury in each group

2.4 各组心肌细胞活性比较

结果显示，空白对照组与Sham组比较心肌细胞活性无统计学差异 （P＞ 0.05）。与Sham组比较，MCM组与Tub A组心肌细胞活性明显降低 （P＜ 0.001）；与MCM组比较，Tub A组心肌细胞活性明显升高 （P＜0.001），见图3。

图3 各组心肌细胞活性比较Fig.3 Comparison of myocardial cell activity in each group

3 讨论

3.1 经LPS刺激的巨噬细胞可以导致心肌细胞氧化应激和损伤

本研究结果显示，使用经LPS刺激巨噬细胞的上清液培养心肌细胞后，细胞内ROS 及脂质过氧化产物MDA水平均显著增加，LDH和CK-MB释放明显增加，同时细胞活性明显下降，提示经LPS刺激的巨噬细胞可以导致心肌细胞氧化应激和损伤。

JI等［16］、RUAN等［18］研究结果与本研究相似，经LPS刺激的巨噬细胞使心肌细胞发生氧化应激损伤，加剧细胞的炎症反应。过量产生的ROS可抑制线粒体氧化磷酸化，减少细胞内ATP的产生，使细胞活性下降。另外，磷脂膜对ROS的攻击十分敏感，可发生脂质过氧化，产生MDA和4-羟基壬烯酸等脂质过氧化产物［19］，这些产物可以破坏DNA、蛋白质和酶活性，并激活信号通路，引发细胞的自噬、凋亡、铁死亡等［20］；大量ROS导致脂质过氧化还可破坏细胞膜结构，导致通透性增加，大量释放心肌酶及其他细胞损伤标志物［21］。

3.2 Tub A可减轻经LPS刺激的巨噬细胞所致的心肌细胞氧化应激和损伤

本研究结果显示，应用Tub A对心肌细胞进行干预后，细胞内ROS 及脂质过氧化产物MDA水平均明显降低，细胞释放LDH明显减少，CK-MB作为临床和体外实验中诊断脓毒症心肌损害的关键指标，同样呈下降趋势。此前已有研究［14］证实，Tub A在星形胶质细胞、乳腺上皮细胞等的脓毒症模型中具有减轻氧化应激损伤的作用，且在缺氧/复氧的H9C2心肌细胞中也具有减少ROS产生的作用［17］，因此Tub A可能通过降低细胞的氧化应激水平，减轻经LPS刺激的巨噬细胞所致的心肌细胞损伤。

大量研究证实，巨噬细胞受LPS等刺激发生M1极化，形成促炎表型，产生促炎性细胞因子，而NO可作为巨噬细胞发生M1极化的标志物之一。本研究中LPS刺激后的RAW264.7巨噬细胞产生大量NO，可以认为其发生了M1极化，形成促炎表型。脓毒症引起的靶器官损伤来自于PAMPs、DAMPs的共同作用［7］。本研究应用LPS刺激巨噬细胞获得的上清液，同时具备了PAMPs和DAMPs，模拟脓毒症时复杂的内环境，成功构建体外细胞模型，符合脓毒症心肌损害的病理机制。此外，众多研究［22-24］表明，氧化应激损伤是脓毒症心肌损害发生的重要病理生理过程，即心肌细胞内ROS、MDA含量、心肌细胞损伤标志物的释放水平及细胞活性的改变，与本研究结果一致。JI等［16］、RUAN等［18］同样应用本研究方法成功建立了脓毒症心肌损害体外模型，故应用此方法建立体外脓毒症心肌损伤模型具有较高科学性。

综上所述，心肌损伤作为急诊科常见的脓毒症并发症，其发生机制与氧化应激损伤有着十分密切的关系。Tub A可以通过减少ROS的产生，减轻脓毒症导致的心肌细胞氧化应激损伤，进而保护心肌细胞，提高心肌细胞的生存率，维持心脏功能的稳定。本研究为体外实验，无法完全模拟复杂的体内过程，因此有待体内实验进一步验证。