丹参酮IIA保护脓毒症诱发肠屏障功能障碍的作用及机制

王希 冯丹丹 潘思旭 邢茜 夏国莲 江荣林

脓毒症为临床常见的危重病症，是人体对感染反应失调而致危及生命的器官功能障碍，具有较高的发生率和死亡率［1］。肠屏障功能与脓毒症密切相关［2］，肠屏障包括机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障，正常生理状态下肠屏障能保护机体免受肠内微生物及外界病原体的入侵，维持机体正常运转［3］。然而在脓毒症的病理状态下，肠屏障结构和功能发生变化，肠道内的细菌和毒素突破屏障进入其他器官或血液，刺激炎症因子释放，影响胞间紧密连接蛋白的表达，改变肠上皮细胞通透性，加重患者病情，甚至出现多器官衰竭［4-5］，因此，通过保护肠屏障功能治疗脓毒症具有重要的临床意义。丹参酮IIA 具有抗氧化、抗炎等作用，目前用于治疗心血管疾病、肾缺血再灌注损伤、肝病等［6-8］，同时丹参酮IIA 还能通过发挥抗炎作用保护脓毒症小鼠神经损伤［9］，缓解脓毒症小鼠急性肺损伤［10］。本研究采用LPS 诱导人肠上皮细胞株Caco2 构建脓毒症细胞模型，检测丹参酮IIA 对肠上皮细胞紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1 及炎症因子IL-17A、IL-17C 的影响，同时检测细胞外信号调节激酶（ERK）蛋白的表达水平及磷酸化程度，阐明丹参酮IIA 对脓毒症模型紧密连接蛋白的作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人结直肠腺癌细胞株Caco2，购于武汉普诺赛。Caco2 细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，培养箱条件为37℃、5% CO2，待其生长密度为80%~90%时进行传代。

1.2 主要试剂 丹参酮IIA（Solarbio，北京，ST8020），脂多糖（LPS）（SIGMA，美国，L2880），DMEM 培养基（GIBCO，美国，11995065），胎牛血清（FBS）（GIBCO，美 国，10270106），Trizol（Invitrogen， 美 国，1596-026），FITC-右旋糖酐（SIGMA，美国，53379），逆转录试剂盒（Fermentas，加拿大，K1622），SYBR Green PCR 试剂盒（Thermo，美国，K0223），引物均由上海生工生物工程有限公司合成。ZO-1 抗体、Occludin 抗体、Claudin-3 抗体、ERK 抗体、p-ERK 抗体、JAM 抗体均购自Affinity Biosciences（亲科，江苏），GAPDH 抗体（Abcam，英国，ab37168），辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（碧云天，江苏，A0208）。

1.3 主要仪器 CO2恒温培养箱（SANYO，MCO-15AC），酶标仪（Thermo，MULTISKAN MK3），荧光定量PCR 仪（ABI 公司，ABI-7300），垂直电泳仪（Bio-Rad，014BR），倒置显微镜（Carl Zeiss，Axio Vert.A1），台式冷冻高速离心机（Eppendorf，5430R），凝胶成像仪（Bio-Rad，ChemiDoc XRS+System）。

1.4 通透性检测 在Transwell 上室加入80 µL Matrigel（4 µg/uL），37 ℃ 放置30 min 使其聚合成凝胶。调整细胞浓度至5×104个/mL，取200 µL 细胞悬液加入Transwell 上室，待细胞长满后，在上室中加入FITC 标记的葡聚糖和不同浓度LPS，下室加入500 µL含10% FBS 的DMEM 培养液。于LPS 处理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h 后，吸取下室100 µL 液体到96 孔板中，测量FITC 的OD 值，计算各组细胞的通透率。

1.5 Western Blot 检测 收集各处理组细胞，经PBS洗涤后加入RIPA 裂解液，充分裂解后收集裂解液，12,000 r/min 离心15 min，取上清液即为细胞总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度。配制10%浓度的分离胶和5%浓度的浓缩胶，以蛋白上样量为20µg/孔进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后采用PVDF 膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，孵育一抗ZO-1，Occludin，Claudin-3，ERK，p-ERK，JAM，4℃摇床震荡孵育过夜。TBST 洗膜3 次，10 min/次，随后室温孵育二抗1 h，经TBST洗膜3 次后，ECL 发光液显影，凝胶成像仪进行曝光。

1.6 RT-PCR 检测 采用Trizol 法提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒将总RNA 逆转录成cDNA，随后用SYBR Green PCR 试剂盒进行扩增，IL-17A 上游引物（5’-TGTGATCTGGGAGGCAAAGT-3’），IL-17A 下游引物（5’-CCCACGGACACCAGTATCTT-3’），IL-17C上游引物（5’-GACCGCTATCCACAGAAGCT-3’），IL-17C 下游引物（5’-GACGTGGATGAACTCGGTGT-3’），反应条件为：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，40 个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件。所有实验均重复3 次，计量资料用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS 诱导肠上皮细胞构建脓毒症肠屏障损伤模型 肠上皮细胞Caco 2 经100 µg/mL LPS 处理后，分别在不同时间段检测细胞通透性，结果显示，经LPS 处理3 h 后Caco2 细胞通透率较对照组显著上升（P<0.01），见图1。其在3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 及72 h 的通透率分别为208.58%、280.99%、393.15%、535.63%、817.27%、1062.63%。不同浓度0、0.1、1、10、50、100 及200µg/mL 的LPS 处理Caco2 细胞3 h 后，检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin 及Claudin-1 表达水平，结果显示0、0.1、1、10、50 µg/mL 的LPS 对ZO-1、Occludin 及Claudin-1 的表达水平无影响（P>0.05），而100、200 µg/mL 的LPS 能显著抑制ZO-1、Occludin及Claudin-1 的表达（P<0.05）。见图2。Caco2 细胞经100 µg/mL LPS 处理不同时间后，其紧密连接蛋白ZO-1、Occludin 及Claudin-1 的表达水平在1 h 内无显著变化（P>0.05），在3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h均显著下降，且随着时间的延长呈依赖性下降。因此，本研究采用100µg/mL LPS 处理3 h 构建脓毒症肠屏障功能障碍细胞模型。

图1 LPS在不同时间点对Caco2细胞紧密连接蛋白的影响

图2 不同浓度LPS影响Caco2细胞紧密连接蛋白的表达

2.2 丹参酮IIA 对肠黏膜紧密连接蛋白的影响 与正常对照组相比，模型组中LPS 能显著抑制Caco2 细胞紧密连接蛋白的表达（P<0.05），经0.14、0.68、3.4 µmol/L 的丹参酮IIA 处理后，ZO-1、Occludin 及Claudin-1 蛋白表达水平较LPS 组均上升（P<0.05）。见图3。

图3 不同浓度TAN IIA对LPS处理后的Caco2细胞紧密连接蛋白表达的影响

2.3 丹参酮IIA对Caco2炎症因子的影响 与正常对照组相比，LPS 能显著升高Caco2 细胞炎症因子IL-17A 及IL-17C mRNA的水平（P<0.01），而经丹参酮IIA处理后，IL-17A 及IL-17C mRNA 表达水平显著下降（P<0.05）。见图4。

图4 LPS及丹参酮IIA处理对Caco-2细胞中IL-17A和IL-17C表达的影响

2.4 丹参酮IIA 通过p-ERK 调节紧密连接蛋白的表达 与正常对照组相比，LPS 组、丹参酮IIA组、LPS+SLIGRL-NH2 组、LPS+TBHQ 组、 丹 参 酮IIA+SLIGRL-NH2 组及丹参酮IIA+TBHQ 组ERK 蛋白表达水平无显著变化，而p-ERK 即ERK 的磷酸化水平有变化。LPS 处理后，Caco2 细胞的ERK 磷酸化水平显著上升（P<0.01），丹参酮IIA 能显著抑制该过程，加入ERK 激动剂TBHQ 或PAR2 激动剂SLIGRL-NH2 可以抑制丹参酮IIA对Caco2细胞ERK磷酸化水平的下调作用，见图5。LPS 可下调Caco2 中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin 及JAM 蛋白表达水平，而丹参酮IIA 处理可使紧密连接蛋白的表达水平恢复，ERK 激动剂TBHQ 或PAR2 激动剂SLIGRL-NH2 则可抑制丹参酮IIA 对LPS诱导下Caco2 细胞中ZO-1、Occludin 及JAM 蛋白表达的恢复作用，见图6。

图5 TAN IIA 处理对LPS诱导下ERK信号通路的影响

图6 丹参酮IIA 对LPS诱导下Caco2细胞中紧密连接蛋白表达影响

3 讨论

脓毒症与肠屏障功能障碍密切相关，脓毒症不仅引起细胞凋亡、坏死，同时感染促进机体释放大量炎症因子，损伤黏膜上皮，增加肠屏障通透性［11］，从而加速脓毒症进展，最终导致多器官衰竭。目前关于脓毒症的治疗方法不断发展，但严重脓毒症患者的死亡率仍然居高不下。丹参酮IIA 具有抗氧化、抗炎、抗凝血、扩张血管、调节免疫等功能［12］，在缓解脓毒症肠屏障功能障碍方面具有巨大潜力。

肠上皮细胞和胞间紧密连接蛋白形成机械屏障，肠上皮细胞主要进行营养物质代谢，维持肠道内环境平衡［13］，胞间紧密连接蛋白包括ZOs、Occludin、Claudin-1和JAMs［14］，连接填充肠上皮细胞间的缝隙，因此紧密连接蛋白表达异常将影响肠黏膜通透性。

大量文献报道，在脓毒症肠屏障功能障碍动物模型中，紧密连接蛋白ZO-1 及Occludin 的表达水平下降，细胞间隙扩大，导致肠屏障通透性增大，而改善紧密连接蛋白表达则能有效缓解肠屏障功能障碍［15-16］，研究者在结肠炎小鼠模型中发现增加ZO-1 和Occludin 的表达，能调节肠屏障通透性，修复肠屏障功能［17］，同时，任何感染或严重创伤等引起肠道屏障稳态改变，进而破坏肠道紧密连接蛋白，增加上皮细胞通透性［18-19］，均提示紧密连接蛋白的表达与肠屏障功能密切相关。本研究结果显示，Caco2 细胞经100 µg/mL LPS 处理3 h 后，细胞通透性上升，同时紧密连接蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-1 表达下降，成功构建脓毒症肠屏障功能障碍细胞模型。经丹参酮IIA 治疗后，ZO-1、Occludin 及Claudin-1 的表达水平较模型组上升，IL-17A 及IL-17C mRNA 的表达水平下降，表明丹参酮IIA 能修复LPS 导致的紧密连接蛋白下调，降低炎症反应，缓解脓毒症肠屏障功能障碍。

细胞外信号调节激酶（ERK）在细胞内分布广泛，参与炎症、细胞凋亡等过程，是维持胃肠道稳态和调节肠屏障功能的重要途径之一。研究表明，在内脏高敏大鼠模型中，激活PAR2/ERK 信号通路，引起ZO-1、Occludin 表达下降，导致肠屏障功能受损［20］。在结肠炎大鼠模型中，激活ERK 信号通路升高炎症水平，紧密连接蛋白表达下降，抑制ERK 蛋白磷酸化则能降低结肠组织中的炎症水平［21］。本研究发现LPS 能诱导Caco2 细胞中p-ERK 水平升高，丹参酮IIA 治疗则能降低p-ERK 水平。在丹参酮IIA 治疗组加入ERK 激动剂TBHQ，结果显示与丹参酮IIA 治疗组相比，TBHQ 能升高p-ERK 水平，并降低紧密连接蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-1 的表达。

综上所述，丹参酮IIA 可能通过抑制ERK 蛋白磷酸化水平，上调紧密连接蛋白的表达，抑制炎症反应，缓解肠屏障功能障碍，具体机制仍需进一步探索。