虎杖苷在白内障大鼠晶状体上皮细胞损伤中的作用机制△

冯 冰 梁明明 钟祖斌

白内障是世界上最常见的致盲性眼病,主要是由于晶状体混浊所致,其发病率与年龄密切相关[1]。尽管白内障的病因和发病机制仍未完全清楚,但目前发现晶状体上皮细胞(LEC)异常凋亡、炎症和氧化应激损伤会诱发晶状体功能障碍,使晶状体混浊度升高,进而诱发白内障形成[2]。目前,白内障的主要治疗方法是手术摘出白内障并植入人工晶状体[3],手术治疗可能产生一些后遗症而影响患者生活质量,因此,寻找能够预防或延缓白内障发生的药物是降低白内障发病率和防止失明的关键。虎杖苷是一种天然的白藜芦醇苷,是从虎杖中提取的主要生物活性化合物,已证实其具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用[4]。已有研究发现虎杖苷滴眼液可抑制高渗应激诱导的干眼症大鼠结膜组织氧化应激和炎症反应[5]。另外,有研究显示转化生长因子-β/Smads(TGF-β/Smads)信号通路参与白内障的发生发展[6]。本研究使用亚硒酸钠诱导的白内障大鼠模型,探讨虎杖苷在白内障大鼠LEC损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50只6日龄SD新生大鼠,雌雄各半,与其母鼠由东南大学提供[动物许可证号:SYXK(苏)2021-0022]。幼鼠体重(18±2)g,所有新生大鼠与其母鼠一起饲养在(23±2)℃,12h/12h明暗循环的动物房中,所有大鼠自由饮水喂食。本研究已获得本院动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

虎杖苷和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司;丙二醛(MDA)检测试剂盒和总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;SRI-011381盐酸盐(hydrochloride)购自美国MCE公司;抗体转化生长因子β(TGF-β)、Smad2、Smad3、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及其相关蛋白Bax、GAPDH和HRP标记山羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司;抗体α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.3 大鼠造模与分组

50只新生大鼠,适应性喂养5 d后,随机分为对照组、激活剂组、模型组、虎杖苷高剂量组、虎杖苷低剂量组,每组10只。除对照组外,其余各组大鼠通过皮下一次性注射25 μmol·kg-1亚硒酸钠建立白内障大鼠模型[7],第2天所有大鼠开始进行双眼生理盐水滴眼或给药。对照组和模型组大鼠使用生理盐水滴眼,虎杖苷低、高剂量组大鼠分别采用1.3 g·L-1和5.0 g·L-1虎杖苷滴眼液滴眼[8],激活剂组大鼠除使用5.0 g·L-1虎杖苷滴眼液滴眼外还需灌胃10 mg·kg-1TGF-β/Smads信号通路的激活剂SRI-011381盐酸盐,其余各组大鼠灌胃生理盐水。虎杖苷滴眼液滴眼每天3次,每次10 μL,SRI-011381盐酸盐给药每天1次,连续14 d。大鼠最后一次给药后禁食12 h,用5.0 g·L-1托吡卡胺和25.0 g·L-1盐酸去氧肾上腺素散瞳,通过裂隙灯生物显微镜评判大鼠白内障晶状体混浊度,然后使用过量戊巴比妥钠麻醉脱颈处死,摘除眼球分离晶状体,从各组随机取5只大鼠左眼晶状体固定在40 g·L-1多聚甲醛中进行HE染色观察,其余晶状体在显微镜下小心分离晶状体囊膜组织并获得LEC用于后续实验。

1.4 晶状体混浊度检测

裂隙灯生物显微镜检查各组大鼠晶状体,晶状体混浊度分为5级[9],其中,0级:透明正常晶状体;1级:晶状体轻微囊下混浊;2级:晶状体囊下混浊并伴随轻微核混浊;3级:晶状体高度混浊且核区混浊加重;4级:晶状体致密性混浊,白内障形成。

1.5 HE染色观察大鼠晶状体病理变化

将固定在40 g·L-1多聚甲醛的5只大鼠左眼晶状体使用石蜡包埋切片后行HE染色,光学显微镜下观察大鼠晶状体病理损伤情况。

1.6 各组大鼠LEC中SOD和MDA水平检测

取各组5只大鼠左眼LEC快速研磨成匀浆,离心后,检测上清液中SOD和MDA水平,使用硫代巴比妥酸(TBA)检测试剂盒检测MDA水平,使用水溶性四唑盐(WST-1)法检测SOD水平,具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

各组取5只大鼠右眼LEC,过200目滤网得到单细胞悬液,随后根据Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书检测LEC凋亡情况。细胞经100 μL Binding Buffer缓冲液重悬,然后加入5 μL Annexin V-FITC染液和PI染色室温避光下孵育15 min,快速使用流式细胞仪检测LEC凋亡情况。

1.8 Western blot检测细胞TGF-β/Smads信号通路相关蛋白表达

取各组剩余5只大鼠右眼LEC,加入裂解缓冲液充分裂解细胞提取总蛋白,使用二辛可酸(BCA)试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白样品加载到100 g·L-1SDS-PAGE凝胶电泳上分离蛋白,将分离的蛋白条带转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,使用50 g·L-1脱脂牛奶封闭2 h,依次加入抗体TGF-β、Smad2、Smad3、α-SMA、Bcl-2、Bax、GAPDH,4 ℃孵育过夜,然后加入辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗,室温下孵育2 h,加入ECL显影,GAPDH作为内参蛋白,使用ImageJ软件量化所得蛋白条带。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 白内障大鼠晶状体病理变化

HE染色结果显示,对照组大鼠晶状体前囊区域结构清晰,LEC与晶状体纤维细胞排列紧密。与对照组相比,模型组大鼠晶状体前囊区域结构紊乱,晶状体纤维细胞变性、肿胀,LEC排列稀疏,晶状体后囊附近发生空泡化。与模型组相比,虎杖苷低、高剂量组明显改善白内障大鼠晶状体结构。与虎杖苷高剂量组相比,激活剂组加重了白内障大鼠晶状体结构损伤(图1)。大鼠晶状体混浊度检测结果显示,对照组、模型组、虎杖苷低剂量组、虎杖苷高剂量组、激活剂组大鼠晶状体混浊度分级分别为0级、(3.64±0.21)级、(2.43±0.18)级、(1.86±0.16)级、(2.75±0.22)级。5组间整体比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,模型组大鼠晶状体混浊度分级明显升高(P<0.05)。与模型组相比,虎杖苷低、高剂量组大鼠晶状体混浊度分级均明显降低(均为P<0.05)。与虎杖苷高剂量组相比,激活剂组大鼠晶状体混浊度分级明显升高(P<0.05)。

2.2 虎杖苷对白内障大鼠LEC中SOD和MDA水平的影响

对照组、模型组、虎杖苷低剂量组、虎杖苷高剂量组、激活剂组大鼠LEC中SOD水平分别为(73.26±3.29)U·mL-1、(40.29±2.65)U·mL-1、(48.62±2.73)U·mL-1、(61.93±3.11)U·mL-1、(52.45±2.86)U·mL-1,MDA水平分别为(1.68±0.21)μmol·L-1、(4.53±0.37)μmol·L-1、(3.75±0.32)μmol·L-1、(3.02±0.26)μmol·L-1、(3.64±0.35)μmol·L-1。5组大鼠LEC中SOD、MDA水平差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组相比,模型组大鼠LEC中SOD水平明显降低,MDA水平明显升高(均为P<0.05)。与模型组相比,虎杖苷低、高剂量组大鼠LEC中SOD水平均明显升高,MDA水平均明显降低(均为P<0.05)。与虎杖苷高剂量组相比,激活剂组大鼠LEC中SOD水平明显降低,MDA水平明显升高(均为P<0.05)。

2.3 虎杖苷对白内障大鼠LEC凋亡的影响

对照组、模型组、虎杖苷低剂量组、虎杖苷高剂量组、激活剂组大鼠LEC凋亡率分别为(4.63±0.41)%、(27.95±1.26)%、(18.35±1.03)%、(11.76±0.74)%、(17.42±0.95)%。5组大鼠LEC凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,模型组大鼠LEC凋亡率明显升高(P<0.05)。与模型组相比,虎杖苷低、高剂量组大鼠LEC凋亡率均明显降低(均为P<0.05)。与虎杖苷高剂量组相比,激活剂组大鼠LEC凋亡率明显升高(P<0.05)(图2)。

图2 流式细胞术检测各组大鼠LEC凋亡情况

2.4 虎杖苷对白内障大鼠LEC中TGF-β/Smads信号通路相关蛋白表达的影响

5组大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表达差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组相比,模型组大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表达均明显升高(均为P<0.05)。与模型组相比,虎杖苷低、高剂量组大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表达均明显降低(均为P<0.05)。与虎杖苷高剂量组相比,激活剂组大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表达均明显升高(均为P<0.05)(表1、图3)。

表1 各组大鼠LEC中TGF-β/Smads信号通路相关蛋白相对表达量

表1 各组大鼠LEC中TGF-β/Smads信号通路相关蛋白相对表达量

组别蛋白相对表达量TGF-βSmad2Smad3对照组0.35±0.040.42±0.050.39±0.03模型组1.13±0.120.97±0.100.82±0.09虎杖苷低剂量组0.86±0.090.73±0.080.64±0.07虎杖苷高剂量组0.52±0.050.55±0.050.47±0.04激活剂组0.75±0.060.69±0.070.59±0.06F75.63740.60835.825P0.0000.0000.000

2.5 虎杖苷对白内障大鼠LEC中α-SMA、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

5组大鼠LEC中α-SMA、Bax、Bcl-2蛋白表达差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组相比,模型组大鼠LEC中α-SMA、Bax蛋白表达均明显升高,Bcl-2蛋白表达明显降低(均为P<0.05)。与模型组相比,虎杖苷低、高剂量组大鼠LEC中α-SMA、Bax蛋白表达均明显降低,Bcl-2蛋白表达均明显升高(均为P<0.05)。与虎杖苷高剂量组相比,激活剂组大鼠LEC中α-SMA、Bax蛋白表达均明显升高,Bcl-2蛋白表达明显降低(均为P<0.05)(表2、图4)。

图3 各组大鼠LEC中TGF-β/Smads信号通路相关蛋白表达情况

表2 各组大鼠LEC中α-SMA、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量

表2 各组大鼠LEC中α-SMA、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量

组别蛋白相对表达量α-SMABcl-2Bax对照组0.63±0.080.93±0.090.56±0.06模型组1.37±0.130.45±0.041.03±0.11虎杖苷低剂量组1.11±0.120.59±0.060.87±0.07虎杖苷高剂量组0.79±0.070.81±0.070.62±0.05激活剂组0.98±0.080.63±0.050.79±0.08F41.77643.14030.619P0.0000.0000.000

图4 各组大鼠LEC中α-SMA、Bcl-2、Bax蛋白表达情况

3 讨论

LEC是围绕着晶状体的前囊和赤道部分的单层细胞,在维持整个晶状体的透明度和内部环境的稳定性方面发挥着重要作用,并保护晶状体处于透明状态[10]。研究发现,氧化应激发生在白内障早期阶段,LEC氧化应激和异常凋亡在白内障发病机制中发挥重要作用[11]。亚硒酸盐诱导的动物白内障反应与人类白内障反应相似,已广泛应用于实验医学模型中,以筛选和评估抗白内障药物的治疗潜力[12]。本研究通过向大鼠皮下注射亚硒酸钠诱导建立白内障大鼠模型,结果发现模型组大鼠晶状体前囊区域结构紊乱,晶状体纤维细胞变性、肿胀,LEC排列稀疏,晶状体后囊区域附近发生空泡化,大鼠晶状体混浊度分级增加,提示白内障大鼠造模成功。与对照组相比,模型组大鼠LEC中MDA水平、细胞凋亡率以及促凋亡蛋白Bax表达的升高和SOD水平以及Bcl-2蛋白表达的降低,这一结果与汪雪梅[11]的研究结果基本一致,表明白内障大鼠LEC发生氧化应激及异常凋亡。虎杖苷的治疗和保护作用主要来源于其抗炎、抗氧化和抗凋亡活性,其可通过抑制氧化应激和炎症缓解泪腺切除诱导的干眼症大鼠角膜和结膜组织损伤[5,13]。本研究通过向白内障大鼠眼内给药虎杖苷发现,虎杖苷可明显减轻白内障大鼠晶状体结构损伤,并减轻大鼠晶状体混浊度,降低LEC中MDA水平、细胞凋亡率以及Bax蛋白表达,升高LEC中SOD水平以及Bcl-2蛋白表达,这一结果与Park等[5]研究结果基本一致,表明虎杖苷可通过抑制白内障大鼠LEC氧化应激和凋亡,缓解白内障大鼠LEC损伤,对白内障大鼠起到治疗作用。

已有研究表明,TGF-β可以通过调节细胞增殖、存活、分化和迁移来控制细胞的发育过程[14],且TGF-β可与Smad介质相互作用,TGF-β/Smads信号通路由激活的TGF-β释放启动与TGF-β受体结合,之后激活其底物Smad2和Smad3蛋白,然后与共同介质Smad4形成复合物后直接进入细胞核进一步参与多个基因靶标转录,这些基因靶标负责产生α-SMA,而α-SMA是成熟肌成纤维细胞的标志[15-16]。另外,TGF-β可通过调节Smads介导LEC的上皮间质转化,并促进晶状体纤维化[17]。已有研究表明,TGF-β信号通路在先天性白内障前囊中被激活,TGF-β/Smads信号通路的活化可诱导下游α-SMA激活,引起囊下白内障[18]。Zhang等[6]研究表明,过表达MiR-34可通过激活TGF-β/Smads信号通路促进白内障大鼠LEC凋亡,加入TGF-β抑制剂后,观察到LEC中Bax表达下降,Bcl-2蛋白表达升高,并且细胞凋亡率下降,提示TGF-β/Smads信号通路在白内障发生过程中起重要作用。本研究结果表明,与对照组相比,模型组大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3、α-SMA蛋白表达明显升高,虎杖苷明显抑制了白内障大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3、α-SMA蛋白表达,与Hu等[8]研究结果基本一致,提示虎杖苷可缓解白内障大鼠晶状体损伤及LEC凋亡。本研究结果表明,TGF-β/Smads通路激活剂可逆转虎杖苷对白内障大鼠晶状体混浊度及晶状体损伤的保护作用,增加白内障大鼠LEC凋亡及氧化损伤,证实了虎杖苷可通过调节TGF-β/Smads信号通路缓解白内障大鼠LEC损伤。

4 结论

虎杖苷可通过调节TGF-β/Smads信号通路抑制白内障大鼠LEC凋亡和氧化应激,对白内障大鼠LEC起保护作用,为虎杖苷作为白内障治疗药物提供有效的实验依据。