基于共聚焦的基因生物成像系统设计

吴 琼 陈启梦 王 哲 赵梓朝 刘子琦

（1.长春理工大学光电工程学院，吉林 长春 130022；2.长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022；3.吉林省计量科学研究院几何量测量室，吉林 长春 130022）

2016 年9 月，中国建立了 一座全面的国家基因库，它可以收集、存储和分析大量物种的基因信息，并将其应用到医学、气候变化以及生物多样性等领域。随着高通量基因测序技术迅猛发展，它已成为实现各种研究任务的关键工具。其中，最重要的技术是高通量荧光显微成像技术，它从高信息密度基因芯片中快速获取大量荧光标记信号并将其传输至高分辨率相机，经过数据分析处理最终得到准确的基因序列[1]。

尽管显微成像技术在不断发展，但是基因测序的快速发展导致测序通量已经不能满足市场的发展需求[2]。一方面，研究人员需要更多基因数据来破译更多的基因密码；另一方面，全球医疗卫生水平提高，基因测序普及程度变大导致测序需求快速增长，同时基因生物学研究的不断发展又扩展了基因测序的应用领域。因此，基因测序市场的各个厂商都聚焦具有高通量测序产品的研发工作中[3]。

1 基因生物成像仪的基本原理

荧光显微成像是一类使用荧光蛋白或分子标记后对特定样本标记物成像的光学显微成像技术，被广泛应用在生物、医药领域[4]。它的工作原理为当带有荧光探针的样品受到特定波长的激发光照射时，荧光探针标记的样品产生荧光团块，吸收激光能量并发射荧光。这种观察方法可以提高荧光图像本身的真实对比度[5]。荧光显微成像技术可以利用荧光探针对特定样品内部结构进行标记，可以在保证生物样本活性的同时对组织内特定生物结构特性进行精确识别。

如图1 所示，以激光探针为检测光源，将光源针孔和被检测样品针孔共轭，再使用激光进行三维立体扫描或对荧光样品表面进行三维断层立体扫描，从而得到检测高分辨率光学切片图像的荧光显微镜。

图1 共聚焦系统原理图

共聚焦系统具有以下3 个优点：1） 具备三维成像能力。将样品沿Z轴方向移动，使用共聚焦显微镜可以对样品某一层进行成像，从而可以对样本进行三维成像，最终得到三维图像。2） 有效提高信噪比。探测针孔能够阻止杂散光进入探测器，从而提高共聚焦系统的图像对比度和准确度。3） 提高图像分辨率。共聚焦系统比普通的成像系统具备更强的图像分辨能力。通过与相同数值孔径的成像系统对比，共聚焦系统的图像分辨能力比普通成像系统高，最高可达普通成像系统的1.4 倍。在荧光共聚焦系统中，激发光的波长、功率以及光束本身的质量与检测到的荧光强度都会影响成像质量和检测结果。

2 光学系统设计

为了保证光学系统的成像质量，首先要选择合适的照明方式，以实现在探测过程中均匀照明的功能[6]。其次，在根据共聚焦式面阵扫描基因生物成像仪光学系统特点选定激发光源和高精度相机后，结合激发光源的中心波长以及成像相机的分辨率等系统参数，从照明光路和发射光路2 个方面进行光学结构设计，并结合基因生物成像仪的装配质量要求，初步搭建共聚焦式面阵扫描基因生物成像系统。

按照其激发发光物质到达目标样本时的传播路径将显微成像系统的照明方式分为透射式照明方式和半落射式照明方式，根据照明环境又可分为明场和半暗场照明。通过对比各种照明方式的优、缺点，最终选择落射式明场照明方式。

探测器主要分为线阵探测器和面阵探测器。当用于生物基因芯片检测时，需要使用荧光亮度较强的光源，同时在不影响生物细胞的活性的情况下适当延长曝光时间，以保证成像的清晰度。如果采用线阵探测器进行扫描成像，一次曝光就只能获得1 行像素，为了保证足够的荧光强度，还要保证曝光时间不能太短，那么整张载片的扫描时间就会过长，不能满足细胞快速检测的需求。因此，采用面阵探测器，1 次曝光就可以获得几千行像素，当荧光强度、曝光时间相同时，面阵探测器比线阵探测器的扫描速度快几千倍。面阵探测器又有CCD 和CMOS，与传统的CCD 相比，CMOS 芯片具有体积小、质量轻、集成度高以及直接数字图像输出的特点，因此该文选用Manta-G1236 型高分辨率成像相机。

根据面阵扫描基因生物成像仪光学系统的设计要求，采用透射与反射结合的光学系统设计，高精度荧光成像系统采用透射式，激光显微照明系统采用反射式。

激光共聚焦光学系统的设计主要分为照明光路设计和发射光路设计2 个部分。激光器输出的激光束经过由镜组、透镜组成的准直扩束透镜组后变成1 束平行光束，平行光束照射到二向色镜上，被二向色镜反射到物镜，经过物镜聚焦到样品表面。激光会与生物组织样本中的荧光物质相互作用产生荧光，部分荧光信号会沿着入射光路相反方向通过物镜后进入二向色镜，再通过高通滤波片、聚焦透镜以及探测针孔，最终到达探测器，被探测器收集并传到计算机进行图像处理分析，如图2 所示。由于针孔与样品的焦平面处形成共轭关系，因此焦平面以外的反射信号会被针孔滤除，使共聚焦显微镜具有一定的层析能力。光电倍增管可以放大荧光信号并转换为电信号，然后电信号传输到计算机，利用计算机对接收的电信号进行分析，最后得到基因芯片的图像信息。该文设计的激光准直扩束系统由镜组和透镜组成，通过适当地改变透镜光束束腰直径，可以大幅提高透镜激光束照明透镜的准直性、光束平行度。

图2 激光共聚焦光学系统结构图

在整个显微成像系统设计中，显微物镜是显微成像系统中最重要的光学部件，直接决定了光学系统的主要成像参数和成像质量。而其光学数值孔径尺寸又通常用来表征显微物镜表面本身的表面聚光能力，增强物镜的聚光能力，从而提高物镜的分辨率。在设计过程中，采用2 路激光作为激发光源，从而对2 种生物荧光信号进行检测。

在一定浓度下，激发光的光强越大，激发荧光物质所发出的荧光强度就越大[7]。常用的荧光激发光源有汞灯、氙灯、金属卤素灯、大功率LED 以及激光器等。该文选择比较常用的HEX 和FAM 通道作为荧光染料，并采用THORLABS Mounted LED 作为荧光激发的光源。其中，HEX 通道采用具体型号为M530L4 的绿光LED，其发射中心波长为530 nm，带宽为26 nm。FAM 通道以具体型号为M470L4 的蓝光LED作为激发光源，其发射中心波长为470 nm，带宽仅为26 nm。

显微成像系统的设计需要同时考虑光学分辨率和成像视场，再根据设计要求平衡光学分辨率和成像视场。要实现大视场、高分辨的显微成像，就要在保证分辨率的情况下增加成像视场。根据设计指标和要求，计算得出光学系统的初始结构，通过仿真分析并结合像差理论进行像差矫正，从而得到最终设计结果。在共聚焦成像系统中，光学分辨率和成像视场决定于成像物镜的数值孔径NA，物镜的焦距越长，后备孔径处入射光束角度越大，成像视场就越大。

该文选用Manta-G1236 型高分辨率成像相机，最高分辨率可达4112 px×3008 px，像元尺寸为3.45 μm，由此可以得到光学系统的相关参数如下：1） 像高2h。=10mm。2） 截止频率。由（N为极限分辨率；a为像元尺寸）可知，截止频率为

随着显微物镜视场增大，其边缘区域的图像质量也会受到相应的影响。因此，一般要求线视场2y不超过物镜焦距的1/20，即。因此，线视场y=5，系统焦距为200 mm。

根据设计指标和要求，计算得出光学系统的初始结构，通过利用ZEMAX 进行仿真分析，再结合像差理论进行像差矫正，经过反复优化得到最终设计结果。光学系统工作距离为300 mm，物镜放大率β为5 倍，数值孔径NA为0.3，线视场物高2y为10 mm。

整个系统的像差校正分为2 步，先在前、后组透镜中分别进行校正像差，然后再对整个光学系统进行综合平衡。通过分析各个面球差、设置操作数SPHA和LONA对球差进行矫正，不断调整各个面所占权重。同时，结合赛德尔图和点列图的优化，经过多次调整，最终达到球差公差的要求，从而满足系统的设计指标参数和性能要求。

3 ZEMAX 仿真试验

在完成初步的光学结构设计后，利用ZEMAX 光学软件对光学结构进行仿真设计、误差分析以及优化。当进行像差校正时，可以忽略对成像系统的影响相对较小的像差，例如像散、场曲、畸变以及高级像差等，将重点放在控制球差、彗差以及位置色差等对成像系统影响较大的像差上[8]。通过优化可以得到如图3 所示的光学系统整体结构，通过一些像质指标对光学系统的成像质量进行评价，结果表明，该文设计的光学系统符合设计要求。

图3 整体结构三维图

在该文设计的点列图中，艾里斑的半径为5.048 μm，即位于芯片上的点通过该成像装置后被相机所收集到的像为5.048 μm，大于像元尺寸，成像效果可以满足需求。场曲和畸变图表征了整个光学系统具有较高的图像质量，在畸变图分析中还可以进一步发现，全图观察的场畸变率不足1%，表示整个光学系统中的畸变像差得到了矫正。各个视场下的MTF曲线皆接近衍射极限，当空间频率为72.46 lp/mm 时，MTF模值大约为0.35，大于0.30。说明该文所设计的光学成像系统在对比度方面可以满足需求。

4 面阵扫描式基因生物成像系统成像试验

根据共聚焦式面阵扫描基因生物成像仪光学系统特点和装配质量需求，搭建面阵扫描基因生物成像试验装置。

采用微滴生成仪生成微滴，将微滴生成芯片固定到基因生物成像系统试验装置的载物台上，打开白光光源，对微滴生成芯片进行观察。打开FAM 通道的光源，对微滴生成芯片进行观察，采用高精度相机采集成像结果，对图像中所有半径的微滴进行识别和计数[9]。

为了验证所设计基因生物芯片微滴成像扫描系统能够满足使用要求，利用搭建的装置对3 种条件下的基因样本成像效果准确性进行测试。由测试结果可知，设计的基因生物芯片微滴成像扫描系统能够检测出样本中位点的3 种突变类型，分辨率小于或等于10 μm/px，并且可以识别出阴性的基因组DNA 没有阳性扩增点，达到了设计效果。使用搭建的试验装置对已经扩增好的基因成像芯片进行成像，由成像结果可知，增大白光曝光定位液滴数变多，HEX 荧光点识别数变多，拷贝数下降了0.05%。2 个阳性样本的最低检出限小于10 个荧光分子/m2，样本检测的重复性小于或等于10%，符合前期试验设计结果。

5 结语

该文提出一种基于落射照明方式面阵扫描基因生物成像仪光学系统的设计思路，建立了由共聚焦光学显微成像和落射照明方式组成的实时面阵高通量荧光生物成像仪光学系统。使用面阵式扫描方法进行基因成像，与传统的线扫描方法相比，该系统缩短了扫描时间。同时，使用共聚焦光学系统保证了高分辨率成像。采用2 路激光作为生物芯片的激发光源，可以自动切换平台，实现对不同生物荧光信号进行检测的功能，提高了基因荧光成像效率及精准性。采用落射式临界照明可以更好地实现光学系统均匀照明的功能。结果表明，该文设计的基因生物成像显微系统符合前期试验设计结果，可以满足快速高分辨率基因成像的要求，还可以为研究高精度基因生物成像技术提供技术支撑。