HepG2和Huh7细胞CYP3A4、CYP3A5和PXR基因非编码单核苷酸多态性分析

窦瑶杰,郑庆蒙,徐 晨,张莉蓉,杨卫红

1)郑州大学基础医学院法医学系 郑州 450001 2)郑州大学基础医学院药理学系 郑州 450001

药物代谢酶CYP3A4、CYP3A5和孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)在药物代谢方面起着非常重要的作用,其中PXR对CYP3A4和CYP3A5基因表达和调节至关重要[1]。非编码单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)可通过影响剪切,改变基因表达及药物代谢,但多数非编码SNP影响基因表达的机制尚不完全清楚。HepG2和Huh7是用于药物代谢相关研究最常用的肝细胞[2-4],但目前这两种细胞中CYP3A4、CYP3A5和PXR基因的重要非编码SNP的遗传背景信息尚不完全清楚,无法满足相关遗传变异研究的最基本的需求。本研究对HepG2和Huh7细胞中CYP3A4、CYP3A5和PXR基因的重要非编码SNP基因型进行分析,为非编码SNP影响基因表达的机制研究提供遗传背景信息。

1 材料与方法

1.1 主要材料HepG2和Huh7细胞株(上海中科院细胞研究所);基因组DNA提取试剂盒(美国Axygen公司),PCR试剂盒(日本TaKaRa公司),梯度PCR扩增仪和凝胶成像系统[Thermo Fisher Scientific(中国)有限公司],水平电泳槽(美国Bio-Rad公司)。

1.2 非编码SNP多态性分析用基因组DNA提取试剂盒按说明书操作,从培养的HepG2和Huh7细胞中提取DNA。使用Primer在线引物设计软件设计PCR引物或参考文献[5]引物序列,由郑州尚之亚生物技术有限公司合成引物。CYP3A4 9个SNP(rs2242480、rs35599367、rs2740574、rs3735451、rs2246709、rs4646440、rs12333983、rs4646437、rs35564277)、CYP3A5 rs776746和PXR 4个SNP(rs3814055、rs2276706、rs13059232、rs6785049)引物序列及相关信息见表1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳初步验证后送郑州尚之亚生物技术有限公司测序,将测序结果与NCBI中预期序列进行比对。

表1 PCR引物序列及相关信息

2 结果

测序结果见图1～4。

A:CYP3A5 rs77647; B～E:PXR rs3814055、rs2276706、rs13059232和rs6785049

A～I:分别为rs2242480、rs35599367、rs2740574、rs3735451、rs2246709、rs4646440、rs12333983、rs4646437和rs35564277

A:CYP3A5 rs776746;B～E:PXR rs3814055、rs2276706、rs13059232和rs6785049

HepG2和Huh7细胞CYP3A4、CYP3A5和PXR SNP基因型比较结果见表2。在HepG2细胞中CYP3A4 rs2242480、rs3735451、rs2246709、rs4646440、rs12333983都为突变杂合子,而在Huh7细胞中上述前4个SNP为野生纯合子,最后1个为突变纯合子。其余CYP3A4 rs35599367、rs4646437、rs35564277在这两种细胞中都为野生纯合子,而rs2740574都为突变纯合子。

表2 两种细胞CYP3A4、CYP3A5和PXR基因SNP基因型比较

在HepG2和Huh7细胞中CYP3A5 rs776746分别为突变杂合子和突变纯合子。在这两种细胞中,PXR rs3814055、rs2276706、rs6785049为突变杂合子,rs13059232为突变纯合子。

野生纯合子、突变杂合子和突变纯合子在HepG2和Huh7细胞中的数目分别为3、9、2及7、3、4个,即HepG2细胞突变杂合子较多,而Huh7细胞野生纯合子及突变纯合子较多。

3 讨论

CYP3A4、CYP3A5和PXR基因非编码遗传变异的功能及机制研究需要不同基因型的细胞模型,目前基因编辑SNP技术的应用为相关研究创造了条件。HepG2和Huh7细胞系在药物代谢的研究中已被广泛使用,因此,我们对这两种细胞中上述3个基因的重要非编码SNP的基因型进行了比较分析,为遗传变异相关研究提供遗传背景信息。

通过比较HepG2和Huh7细胞中CYP3A4基因的9个SNP及1个CYP3A5 SNP,我们发现HepG2细胞中CYP3A4 rs2242480突变杂合子、rs35599367野生纯合子和CYP3A5 rs776746突变杂合子基因型与我们前期对HepG2细胞的研究[5]结果一致;在Huh7细胞中,CYP3A5 rs776746突变纯合子基因型与以往研究[6]结果一致。另外,HepG2细胞中rs2242480和rs776746这两个SNP都为突变杂合子,Huh7细胞中rs2242480野生纯合子和rs776746突变纯合子,支持rs2242480野生等位基因和rs776746变异等位基因(或rs2242480变异等位基因和rs776746野生等位基因)存在强连锁不平衡关系[7-8]。使用HepG2细胞研究CYP3A4遗传变异对药物代谢的影响时,不用考虑3个野生纯合子SNP(rs35599367、rs4646437和rs35564277)对实验结果的影响,而rs2740574突变纯合子和突变杂合子SNP(rs2242480、rs3735451、rs2246709、rs4646440和rs12333983)则可能对实验结果有影响。使用Huh7细胞研究CYP3A4遗传变异对药物代谢的影响时,不需要考虑7个野生纯合子(rs2242480、rs3735451、rs2246709、rs4646440、rs35599367、rs4646437和rs35564277)对实验结果的影响,而突变纯合子rs12333983和rs2740574可能对实验结果有影响。HepG2和Huh7细胞中CYP3A4及CYP3A5遗传背景不同,进行相关遗传变异或连锁SNP研究时可以根据其基因型选择或改造细胞。

另外,由于PXR影响CYP3A4及CYP3A5的表达,因此,我们也比较了HepG2和Huh7细胞中PXR的SNP变异情况。我们发现在这两种细胞中PXR rs3814055、rs2276706、rs6785049都为突变杂合子,而rs13059232都为突变纯合子,提示这4个PXR SNP可能被CYP3A4及CYP3A5表达所需要,使用这两种细胞用于研究CYP3A4和CYP3A5遗传变异时需要考虑其可能产生的影响。CYP3A4、CYP3A5和PXR SNP在HepG2细胞中突变杂合子较多,而在Huh7细胞中野生纯合子及突变纯合子较多,提示从适应性方面HepG2作为药物代谢相关研究的细胞模型比Huh7细胞的应用范围会更加广泛。而且从PubMed检索“HepG2”及“Huh7”(“Huh-7”)使用情况,分别发现1981至2023年36 336个结果及1982至2022年6 912(2 804)个结果,前者远高于后者,也支持了我们的观点。至于rs2242480作为CYP3A4的增强子[9-10]影响CYP3A4、CYP3A5、PXR基因表达的机制及PXR变异在其中所起的作用有待于深入研究。

综上,HepG2和Huh7细胞中CYP3A4、CYP3A5重要非编码SNP变异情况不完全相同,而PXR SNP基因型相同,HepG2细胞中突变杂合子较多,而Huh7野生纯合子及突变纯合子较多。本研究结果为选择或基因编辑这两种细胞株研究CYP3A4、CYP3A5及PXR相关遗传变异及其机制提供了理论依据。