红天麻与乌天麻镇痛活性比较研究

胡娇娇，王敏 ，钱润 ，华中一 ，田慧 袁媛

1.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200； 2.中国中医科学院中药资源中心，北京 100700；3.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193

天麻为兰科植物天麻Gastrodia elataBL.的干燥块茎，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络等功效[1]。根据天麻的形态学等特征，可分为松天麻G.elataBL. f.alba、黄天麻G.elataBL. f.flavida、乌天麻G.elataBL. f.glauca、绿天麻G.elataBL. f.viridis、红天麻G.elataBL. f.elata共5个变种[2]。清代以前红天麻为商品主流，《名医别录》记载其“生陈仓、雍州及太山、少室”[3]。受自然、社会、交通、人文和种质资源等多种因素综合影响，逐渐向四川、云南、贵州转移[4-5]。云贵地区的乌天麻在清代开始兴起，并逐渐成为天麻的道地药材之一[3]。目前，红天麻和乌天麻作为具有不同遗传背景的优良品系，广泛应用于天麻的生产栽培[5-8]。天麻具有镇静催眠、抗炎镇痛、抗惊厥和抗氧化等活性[9-13]。然而有关红天麻与乌天麻的药理作用差异鲜有报道，黄颖等[14]评估了不同品系天麻冻干粉的抗惊厥及神经保护作用，结果表明红天麻的抗惊厥及神经保护作用更佳。

道地药材临床优效性的物质基础是其独特的化学成分，天麻的主要活性成分和指标性成分为酚类及其苷类[15]。除天麻素、对羟基苯甲醇和巴利森苷类成分外，天麻的其他酚酸类成分[16-17]，如香草酸、丁香酸等也具有抗脑缺血、保护神经系统等多种生物活性[18-19]。本研究以不同产地红天麻和乌天麻共117份样品为研究对象，采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）对乌天麻与红天麻中19个酚酸类成分进行定量分析，探究其含量差异，在此基础上，使用热板致痛和醋酸致痛2种模型评估红天麻、乌天麻及含量差异成分的镇痛作用，以明确红天麻与乌天麻的功效差异及其物质基础，为天麻道地药材开发及临床应用提供参考。

1 仪器、试药与动物

ACQUITY UPLC I-Class系统（包括二元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器和柱温箱），美国Waters公司；QTRAP 6500三重四极杆-线性离子阱质谱仪，美国AB SCIEX公司，配有离子喷雾接口；SB-800DTD型超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；MS-S十万分之一电子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；MM 400混合型球磨仪，Retsch公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Pacific T-Ⅱ型超纯水仪，美国Thermo公司；Centrifuge 5415D型离心机，德国Eppendorf公司；DHG-9145AZ电热干燥箱，上海恒科仪器有限公司；RB-200智能热板仪，成都泰盟软件有限公司。

醋酸泼尼松片（批号160337，浙江仙琚制药有限公司）；对羟基苯甲醛（批号D-058-181216，含量≥99%）、原儿茶醛（批号Y-O32-180426，含量≥99%）、对羟基苯甲酸（批号R-D063-181216，含量≥98%）、丁香酸（批号D-019-180426）、巴利森苷E（批号B-050-151017，含量≥98%）、巴利森苷C（批号B-049-181028，含量≥98%）、对羟基苯甲醇（批号D-105-180905，含量≥98%）、L-焦谷氨酸（批号B25551-200，含量≥99%）、香草醛（批号X-012-171216，含量≥99%）、原儿茶酸（批号R-Y568-181216，含量≥99%）、香草酸（批号X-030-180322，含量≥99%）、巴利森苷B（批号B-048-181022，含量≥99%）、巴利森苷A（批号B-047-181015，含量≥99%）、烟酸（批号Y-062-180426，含量≥99%），北京融成鑫德科技发展有限公司；天麻素（批号110807-201507，含量以96.7%计）、腺苷（批号110879-200202，含量＞99.0%）、苯甲酸（批号100419-201703，含量≥99%）、琥珀酸（批号110896-201602，含量≥99%）、肉桂酸（批号110786-201604，含量≥99%），中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯，美国Merk公司。0.22 μm PTFE滤膜，天津津腾实验设备有限公司。Milli-Q超纯水，其余试剂为分析纯。

117份样品采集于4个天麻主产区，其中红天麻来自陕西省安康市宁陕县25份、湖北省黄冈市英山县20份，乌天麻来自贵州省毕节市大方县30份、云南省昭通市彝良县42份，由中国中医科学院中药资源中心金艳副研究员鉴定，样本保存于中国中医科学院中药资源中心。基于课题组前期建立的红天麻、乌天麻特异性PCR鉴别方法[20]，确认上述样品分别为红天麻GastrodiaelataBL. f.elata和乌天麻G.elataBL. f.glauca的干燥块茎。

SPF级ICR雄性小鼠，体质量16～18 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK（京）2016-0006，使用许可证号SYXK（京）2016-0006。SPF级ICR雌性小鼠，体质量17～19 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK（京）2017-0020，使用许可证号SYXK（京）2021-0006。均饲养于屏障环境，温度20～26 ℃，湿度40%～70%。

2 方法与结果

2.1 UPLC-MS/MS检测

色谱条件：采用ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美国Waters公司），流动相为0.1%甲酸-乙腈（A）和0.1%甲酸-水溶液（B），梯度洗脱（0 min，1%A；0～2 min，1%～5%A；2～5 min，5%～15%A；5～7 min，15%～30%A；7～7.1 min，30%～95%A；7.1～9 min，95%A；9～9.1 min，95%～5%A；9.1～12 min，5%A），流速0.5 mL/min，柱温40 ℃，样品室温度20 ℃，进样量1 μL。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI），采用负离子检测模式，多反应监测模式（MRM）进行定量分析，离子化温度550 ℃。

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 对照品溶液

精密称取对羟基苯甲醛、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、丁香酸、巴利森苷E、巴利森苷C、腺苷、对羟基苯甲醇、L-焦谷氨酸、原儿茶酸、香草酸、天麻素、巴利森苷B、巴利森苷A、烟酸、香草醛、苯甲酸、肉桂酸、琥珀酸对照品，加50%甲醇水分别制成浓度为2.0 g/L的对照品母液，再制备成终浓度为0.1 g/L的混合对照品溶液；巴利森苷E、巴利森苷C、对羟基苯甲醇、巴利森苷B、巴利森苷A、天麻素再制备成终浓度为0.5 g/L的混合对照品溶液，置于4 ℃冰箱备用。

2.1.2.2 供试品溶液

3 母乳喂养的宝宝满月至4个月的时候会聚肚，每个宝宝聚肚的时间不一定，聚肚后大便会规律的每日一次，但聚肚前会有几天不大便。

精密称取红天麻和乌天麻药材粉末0.05 g（过50目筛），加入50%甲醇水溶液1 mL，称定质量，室温超声提取（功率120 W，频率40 kHz）30 min，再次称定，补足减失的质量，重复提取1次，提取液13000 r/min离心10 min，取2次上清液，合并，0.22 μm滤膜过滤，备用。

2.1.3 红天麻与乌天麻差异成分筛选

参考文献[21-22]方法，采用UPLC-MS/MS对红天麻和乌天麻中19种酚酸类成分进行定量分析，结果见表1。结合P值（P＜0.05）和各成分相对含量发现，红天麻与乌天麻中天麻素、丁香酸、琥珀酸、L-焦谷氨酸含量存在差异。

表1 红天麻与乌天麻中19个酚酸类成分含量测定结果（±sx，%，n≥45）

表1 红天麻与乌天麻中19个酚酸类成分含量测定结果（±sx，%，n≥45）

注：与乌天麻比较，*P＜0.05，**P＜0.01

乌天麻0.28335±0.02380 0.04830±0.01067 0.23577±0.02782 0.00867±0.00159 0.11813±0.02097 0.11846±0.02112 0.00052±0.00010 0.00464±0.00032 0.00327±0.00025 0.00009±0.00001 0.00274±0.00045 0.00163±0.00022 0.00038±0.00003 0.00236±0.00022 0.00013±0.00001 0.00019±0.00003 0.00020±0.00002 0.00072±0.00011 0.01156±0.00100成分对羟基苯甲醇天麻素巴利森苷E巴利森苷C巴利森苷B巴利森苷A苯甲酸琥珀酸对羟基苯甲醛烟酸L-焦谷氨酸原儿茶醛对羟基苯甲酸肉桂酸香草醛原儿茶酸香草酸丁香酸腺苷红天麻0.20839±0.01640*0.10126±0.02364*0.31554±0.03220*0.01135±0.00230*0.15368±0.03081*0.15082±0.03207*0.00080±0.00013*0.00667±0.00073**0.00333±0.00035 0.00002±0.00000**0.00332±0.00056 0.00144±0.00027 0.00035±0.00003 0.00331±0.00028**0.00016±0.00002 0.00022±0.00004 0.00017±0.00002 0.00253±0.00030**0.01297±0.00066

2.2 镇痛药效评价

2.2.1 药液制备

取红天麻、乌天麻药材粉碎，过80目筛，再用120目筛过筛，得80～120目普通粉[23]。分别称取红天麻、乌天麻适量，加超纯水制成浓度为2 g/mL的母液，稀释成梯度浓度（1、0.5、0.25 g/mL）的溶液。

分别称取天麻素、丁香酸、琥珀酸、L-焦谷氨酸、醋酸泼尼松适量，加超纯水制成浓度依次为0.04、0.04、0.236、0.3、2 mg/mL的药液。

2.2.2 红天麻与乌天麻镇痛作用比较

2.2.2.1 热板法

参考文献[24]选用ICR雌性小鼠，先将热板预热至55 ℃左右，观察并记录小鼠从被放置于热板上至舔后足的反应时间（s），为痛阈值。筛选痛阈值合格（5～30 s）的小鼠72只，随机分为8组，分别为空白对照组，阳性对照组（醋酸泼尼松片20 mg/kg），乌天麻高、中、低剂量组（10、5、2.5 g/kg），红天麻高、中、低剂量组（10、5、2.5 g/kg），每组9只。给药组分别灌胃相应药液，灌胃体积为10 mL/kg，空白对照组灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续14 d。末次给药后测定各组小鼠痛阈值。参考2020年版《中华人民共和国药典》天麻的用法用量[1]及前期镇痛研究[23，25]设置给药剂量。

与空白对照组比较，阳性对照组能显著提高热板致痛的小鼠痛阈值（P＜0.05），红天麻高剂量组作用与阳性对照组相似（P＜0.05），而乌天麻对小鼠痛阈值无明显影响，见表2。

表2 红天麻与乌天麻对小鼠热板法痛阈值影响比较（±sx，s）

表2 红天麻与乌天麻对小鼠热板法痛阈值影响比较（±sx，s）

注：不同字母表示组间比较差异有统计学意义，P＜0.05

痛阈值13.44±1.39b 20.33±2.33a 13.03±1.20b 11.42±0.89b 13.37±0.91b 14.79±0.41b 14.83±0.39b 19.45±2.67a组别空白对照组阳性对照组乌天麻低剂量组乌天麻中剂量组乌天麻高剂量组红天麻低剂量组红天麻中剂量组红天麻高剂量组剂量只数20 mg/kg 2.5 g/kg 5.0 g/kg 10.0 g/kg 2.5 g/kg 5.0 g/kg 10.0 g/kg 99999999

2.2.2.2 醋酸扭体法

选取ICR雌性小鼠和雄性小鼠各72只，分别随机分为8组，即空白对照组，阳性对照组（醋酸泼尼松片20 mg/kg），乌天麻高、中、低剂量组（10、5、2.5 g/kg），红天麻高、中、低剂量组（10、5、2.5 g/kg），每组9只。各给药组分别灌胃相应药液，灌胃体积均为10 mL/kg，空白对照组灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续14 d。末次给药30 min后，小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸0.1 mL/10 g，观察并记录注射后15 min内小鼠扭体反应次数[24]。

红天麻和乌天麻均有减少雄性小鼠醋酸扭体反应次数的趋势。与空白对照组比较，乌天麻中剂量组、乌天麻高剂量组、红天麻中剂量组、红天麻高剂量组均可显著减少醋酸致痛后15 min内雄性小鼠扭体次数（P＜0.05）。与空白对照组比较，红天麻高剂量组可显著减少醋酸致痛后15 min内雌性小鼠扭体次数（P＜0.05），乌天麻组对于减少雌性小鼠醋酸扭体反应无显著作用（P＞0.05）。见表3。

表3 红天麻与乌天麻对雄性和雌性小鼠扭体次数影响比较（±sx）

表3 红天麻与乌天麻对雄性和雌性小鼠扭体次数影响比较（±sx）

注：不同字母表示组间比较差异有统计学意义，P＜0.05

雌性25.56±2.27ab 18.00±2.05c 20.56±2.89bc 21.89±2.13bc 25.56±2.79ab 24.22±3.00abc 29.44±2.97a 18.11±2.79c组别空白对照组阳性对照组乌天麻低剂量组乌天麻中剂量组乌天麻高剂量组红天麻低剂量组红天麻中剂量组红天麻高剂量组剂量只数20 mg/kg 2.5 g/kg 5.0 g/kg 10.0 g/kg 2.5 g/kg 5.0 g/kg 10.0 g/kg 99999999雄性27.78±2.84a 11.00±1.65c 21.33±2.70b 10.44±1.64c 12.89±1.48c 14.22±2.37c 13.00±1.46c 12.56±2.24c

2.2.3 红天麻与乌天麻差异成分的镇痛作用

2.2.3.1 热板法

按“2.2.2.1”项下方法，选取ICR雌性小鼠81只，随机分为9组，分别为空白对照组，丁香酸高、低剂量组（400、200 mg/kg），琥珀酸高、低剂量组（236、118 mg/kg），天麻素高、低剂量组（400、200 mg/kg），L-焦谷氨酸高、低剂量组（100、50 mg/kg），每组9只，给药组分别灌胃相应药液，灌胃体积10 mL/kg，每日1次，连续5 d。末次给药后测定各组小鼠痛阈值。

与空白对照组比较，天麻素高剂量组、琥珀酸低剂量组、琥珀酸高剂量组、L-焦谷氨酸低剂量组和L-焦谷氨酸高剂量组均能显著提高小鼠热板致痛的痛阈值（P＜0.05），琥珀酸组、L-焦谷氨酸组存在一定剂量依赖性，其他组无显著作用（P＞0.05）。见表4。

表4 红天麻与乌天麻差异成分对小鼠热板法痛阈值影响比较（±sx，s）

表4 红天麻与乌天麻差异成分对小鼠热板法痛阈值影响比较（±sx，s）

注：不同字母表示组间比较差异有统计学意义，P＜0.05

组别空白对照组丁香酸低剂量组丁香酸高剂量组天麻素低剂量组天麻素高剂量组琥珀酸低剂量组琥珀酸高剂量组L-焦谷氨酸低剂量组L-焦谷氨酸高剂量组痛阈值13.54±0.73d 15.13±0.63cd 17.20±1.57bcd 15.72±1.13cd 17.66±0.90bc 16.44±0.70cd 22.01±2.57a 15.10±0.80cd 21.07±2.24ab剂量/（mg/kg）只数200400 200400 118236 50100 999999999

2.2.3.2 醋酸扭体法

选取ICR雄性小鼠81只，随机分为9组，分别为空白对照组，丁香酸高、低剂量组（400、200 mg/kg），琥珀酸高、低剂量组（236、118 mg/kg），天麻素高、低剂量组（400、200 mg/kg），L-焦谷氨酸高、低剂量组（100、50 mg/kg），给药组分别灌胃相应药液，灌胃体积10 mL/kg，每日1次，连续5 d。末次给药30 min后，小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸0.1 mL/10 g，观察并记录注射后15 min内小鼠扭体反应次数。

与空白对照组比较，丁香酸低剂量组、丁香酸高剂量组、天麻素低剂量组、天麻素高剂量组、琥珀酸低剂量组、琥珀酸高剂量组、L-焦谷氨酸低剂量组、L-焦谷氨酸高剂量组均可显著减少醋酸致痛后15 min内小鼠的扭体次数（P＜0.01），其中琥珀酸、L-焦谷氨酸减少小鼠扭体次数效果更好。见表5。

表5 红天麻与乌天麻差异成分对小鼠扭体反应次数影响比较（±sx）

表5 红天麻与乌天麻差异成分对小鼠扭体反应次数影响比较（±sx）

注：不同字母表示组间比较差异有统计学意义，P＜0.01

组别空白对照组丁香酸低剂量组丁香酸高剂量组天麻素低剂量组天麻素高剂量组琥珀酸低剂量组琥珀酸高剂量组L-焦谷氨酸低剂量组L-焦谷氨酸高剂量组扭体次数25.11±2.63a 15.78±1.13b 13.00±1.31bc 13.00±1.89bc 13.33±0.91bc 10.89±1.29bc 10.00±1.76bc 7.56±4.38c 8.44±1.14c剂量/（mg/kg）只数200400 200400 118236 50100 999999999

3 讨论

天麻始载于《神农本草经》，红天麻、乌天麻是目前栽培生产的主要品系[3，5，26]。《本草纲目》记载天麻为治风神药[27]，用于肝虚头痛、风湿痹痛等[9]。天麻酚类成分具较强的镇痛作用[28-29]，但有关天麻不同品系及其酚类差异成分对镇痛药效的影响鲜见报道。本研究测定天麻19个酚酸类成分含量，发现天麻素、琥珀酸、L-焦谷氨酸、丁香酸4种化合物在红天麻与乌天麻中存在含量差异。其中天麻素为天麻的主要活性成分之一，其镇痛作用较为显著[30-31]。

本研究利用热板致痛法和醋酸扭体法对乌天麻、红天麻及其差异成分的镇痛作用进行比较。其中热板致痛法为物理性镇痛实验方法，以热刺激开始至小鼠出现舔后足反应的潜伏期反应时间作为测痛指标[32]。醋酸扭体法为化学刺激法，通过给予小鼠腹腔内注入化学物质，引起腹部深部的扭体反应疼痛刺激来评价药物的镇痛作用[33]。热板致痛法一般用于评价中枢参与的镇痛作用，而醋酸扭体法用于外周镇痛药物的筛选[34]。在不同镇痛模型中，红天麻和乌天麻及其酚酸类差异成分的镇痛效果存在明显差异，其中红天麻对外周性疼痛和中枢性疼痛均有一定的镇痛作用，但对中枢性疼痛镇痛效果更好，而乌天麻仅对中枢性疼痛有镇痛效果；红天麻与乌天麻4种差异成分天麻素、丁香酸、琥珀酸、L-焦谷氨酸均具有中枢性镇痛作用，且琥珀酸、L-焦谷氨酸的中枢性镇痛作用更为显著。上述结果与天麻临床多用于治疗偏头痛[35-36]一致，可为进一步探究红天麻和乌天麻在镇静催眠、抗惊厥、抗眩晕等中枢神经性疾病是否存在差异及作用机制研究奠定基础。