唐古特大黄不同极性部位体外抗炎作用谱效关系研究

曹强 ，郭亚菲 ，叶蕾蕾 ，张成园 ，寇仁博 ，王志旺，，郭玫，

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省高校中（藏）药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000

中药指纹图谱是一种综合、可量化的色谱鉴定手段，可以比较全面地反映中药材及制剂的化学成分及特征，进而评价其质量稳定性及一致性。中药谱效关系是建立在指纹图谱基础上，将指纹图谱和药效学通过化学计量学模型进行关联，建立综合评价化学成分与药效活性为一体的质量评价模式，能够揭示化学成分与药效之间的相关性，指导和推进中药活性物质基础的研究，为提升中药的内在品质提供保障，近年来广泛用于中药和复方的药效物质基础研究[1-3]。

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatumL.、唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim. ex Balf或药用大黄Rheum officinaleBaill.的干燥根及根茎，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄功效[4]。现代研究表明，大黄主要含有蒽醌、蒽酮、鞣质、二苯乙烯、黄酮、多糖等多种化学成分，具有泻下、抗炎、抗肿瘤、保肝、保护心血管等药理作用[5-8]。目前已有关于大黄醇提取物或大黄中单一成分抗炎活性的研究，但尚未从整体化学组分水平研究其抗炎相关性物质，无法全面、系统地表征唐古特大黄抗炎药效物质基础。本研究运用体外细胞培养技术检测唐古特大黄甲醇提取物及不同极性部位体外抗炎的生物活性，将HPLC指纹图谱与体外药效实验结果相结合，采用偏最小二乘回归法（partial least squares regression，PLSR）对谱效关系进行研究，考察唐古特大黄甲醇提取物及其不同极性部位萃取物HPLC指纹图谱特征峰与体外炎症因子抑制作用的相关性，确定各成分对药效的贡献，以期阐明唐古特大黄抗炎作用的药效物质基础，进一步得到其抗炎有效部位，为唐古特大黄抗炎药效物质辨识与质量控制模式的建立提供依据。

1 仪器、试药与细胞

Agilent1260型高效液相色谱仪，美国Agilent Technologies公司；BT125D电子分析天平（十万分之一），赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-700DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Benchmark plus型酶标仪，上海新振仪器设备有限公司；IX53倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；371型二氧化碳培养箱，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；IC1000型Countstar自动细胞计数仪，上海睿钰生物科技有限公司。

唐古特大黄药材，2017年秋于甘肃甘南州合作市采集，经甘南科技开发交流中心甘玉伟农业技术推广研究员鉴定为蓼科植物唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim. ex Balf的干燥根及根茎。

RAW264.7专用培养基（DMEM+10%FBS+1%P/S，批号WH01112202XP28），武汉普诺赛生命科技有限公司；芦荟大黄素（批号531B024，纯度98%）、大黄酸（批号109C021，纯度98%）、大黄素（批号1205A0210，纯度98%）、大黄酚（批号523D025，纯度98%）、大黄素甲醚（批号718C023，纯度98%）、没食子酸（批号725G028，纯度98%）、(±)-儿茶素（批号1124H021，纯度98%），北京索莱宝科技有限公司；番泻苷A（批号AF9111318，纯度98%）、番泻苷B（批号AF9111319，纯度98%），成都埃法生物科技有限公司；脂多糖（批号820F036）、噻唑蓝（MTT，批号917Q054）、二甲基亚砜（DMSO，批号1121E0324），Solarbio公司；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

RAW264.7细胞株（批号WXAKX9OB0N，武汉普诺赛生命科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 唐古特大黄不同部位制备

称取唐古特大黄药材粉末（过4号筛）10 g，加甲醇（料液比1∶50），（30±5）℃超声提取（功率350 W，频率20 kHz）1 h，过滤，滤液40 ℃水浴蒸干，得甲醇总提取物。用水复溶，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取至近无色，合并各自萃取液，40 ℃水浴蒸干，得唐古特大黄甲醇总部位（A）、石油醚部位（B）、二氯甲烷部位（C）、乙酸乙酯部位（D）和水部位（E）。将干燥粉末置于干燥器中保存，备用。

2.2 指纹图谱建立

2.2.1 供试品溶液制备

3.切实发挥好四个作用。党员领导干部在市场开拓中要发挥好“管理协调”作用，在经营创收中要发挥好“引领激励”作用，在安全稳定中要发挥好“控制防范”作用，在精细管理中要发挥好“执行表率”作用。切实引导全体干部员工把思想汇聚到打造一流上、智慧集聚到打造一流上、力量凝聚到打造一流上，切实为公司发展挑重担、负责任，为员工当先锋、作表率。

取唐古特大黄5个不同部位（A～E）各约0.005 g，精密称定，甲醇超声溶解并定容至5 mL，得1 mg/mL溶液，过滤，即得供试品溶液A～E。

2.2.2 对照品溶液制备

精密称取大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚、(±)-儿茶素、没食子酸，番泻苷A及番泻苷B对照品适量，配制成1 mg/mL的对照溶液，各吸取1 mL于10 mL容量瓶中，得混合对照品溶液。

2.2.3 色谱条件

采用AgilentTC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～6 min，10%～30%A；6～13 min，30%～33%A；13～21 min，33%～37%A；21～25 min，37%～40%A；25～35 min，40%～45%A；35～45 min，45%～48%A；45～49 min，48%～52%A；49～54 min，52%～60%A；54～64 min，60%～95%A；64～74 min，95%～10%A；74～78 min，10%～10%A），流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长280 nm，进样量10 μL。

2.2.4 精密度试验

分别精密量取供试品溶液A～E适量，按“2.2.3”项下色谱条件连续进样6次，计算各色谱图上分离度较好、响应值较高的色谱峰保留时间和峰面积RSD，结果RSD＜3.0%，表明仪器的精密度良好。

2.2.5 稳定性试验

分别精密量取供试品溶液A～E适量，于0、2、4、6、8、12 h按“2.2.3”项下色谱条件检测，计算各色谱图上分离度较好、响应值较高的色谱峰保留时间和峰面积RSD，结果RSD＜3.0%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.6 重复性试验

分别精密称取A～E样品适量，各平行6份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.3”项下色谱条件检测，计算各色谱图上分离度较好、响应值较高的色谱峰保留时间和峰面积RSD，结果RSD＜3.0%，表明此方法重复性良好。

2.2.7 HPLC图谱特征色谱峰标定

分别取“2.2.1”项下供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件分别连续进样3次，进行HPLC图谱分析，对分离度较好、出峰较稳定的色谱峰进行标定，相同保留时间下的色谱峰记为同一峰号，在同一时间没有峰的部位记为0。

唐古特大黄各部位的特征峰峰面积结果见表1。经与对照品比对，指认1号峰为没食子酸，2号峰为儿茶素，11号峰为番泻苷B，14号峰为番泻苷A，23号峰为芦荟大黄素，27号峰为大黄酸，28号峰为大黄素，29号峰为大黄酚，30号峰为大黄素甲醚。对照品及供试品HPLC图见图1、图2。

图2 唐古特大黄各部位HPLC图

表1 唐古特大黄不同极性部位HPLC图特征峰峰面积

2.3 体外抗炎实验

2.3.1 细胞处理

RAW264.7细胞于37 ℃、5%CO2、饱和湿度环境下培养于专用培养基中，取对数生长期的细胞悬液，以200 μL（2×105个/孔）接种于96孔培养板内，培养12 h后进行后续实验。

2.3.2 唐古特大黄不同部位对RAW264.7细胞存活率的影响

实验分为空白组、正常组、唐古特大黄不同部位组（加药组）。空白组不加RAW264.7细胞，正常组细胞不加唐古特大黄不同部位，加药组细胞分别加入浓度为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 μg/mL唐古特大黄不同部位，每组5个复孔。培养24 h，在避光条件下，每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，混匀后置于CO2培养箱继续孵育4 h，弃去上清液，加入150 μL DMSO，振荡混匀15 min，待各孔中的紫色结晶完全溶解，于570 nm处测OD值。细胞存活率（%）=（加药组OD值-空白组OD值）÷（正常组OD值-空白组OD值）×100%。

唐古特大黄不同部位对RAW264.7细胞存活率的影响见表2。当唐古特大黄不同部位的浓度为1000、500 μg/mL时，细胞存活率可低于90%，各部位为其他浓度时细胞存活率均大于90%。当唐古特大黄不同部位浓度为250 μg/mL时对细胞没有毒性，表明浓度为250 μg/mL及以下时，给药浓度在安全范围内，可以用于后续实验。

表2 各组RAW264.7细胞在唐古特大黄不同部位作用下存活率比较（%）

2.3.3 唐古特大黄不同部位对脂多糖诱导的RAW264.7细胞分泌一氧化氮的影响

将RAW264.7细胞随机分为正常组、模型组及唐古特大黄不同部位组。模型组加脂多糖至终浓度150 ng/mL，唐古特大黄不同部位组加脂多糖至终浓度为150 ng/mL和唐古特大黄不同部位（A～E）至终浓度为100 μg/mL，空白组不做上述处理。每组3个复孔，培养24 h。按试剂盒说明书操作，检测细胞上清液一氧化氮（NO）含量，计算抑制率。采用SPSS25.0统计软件进行分析，组间比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。唐古特大黄不同部位对脂多糖诱导的RAW264.7细胞分泌NO的影响见表3。

表3 各组RAW264.7细胞NO含量及抑制率比较

2.4 谱效关系

利用SIMCA13.0软件，以唐古特大黄不同部位标准化的HPLC特征色谱峰的峰面积为自变量，抗炎率为因变量，构建PLSR模型，进行特征色谱峰和药效指标（抗炎率）回归分析。回归系数和变量重要性投影（VIP）见图3、图4。

图3 唐古特大黄提取物各特征峰峰面积与抗炎率的偏回归系数

图4 唐古特大黄提取物各特征峰峰面积与抗炎率VIP

从图3可以看出，16、23、26、27、28、29、30号峰与抗炎率呈正相关（偏回归系数＞0），其余色谱峰与抗炎率呈负相关（偏回归系数＜0）。VIP用于描述自变量对因变量的解释能力，该值越大（VIP＞1）表示解释能力越强。从图4可以看出，1、11、27、12、28、10、14、23、22、30号峰VIP＞1，表明其对抗炎活性的影响显著。综合分析，唐古特大黄发挥抗炎活性的主要成分可能为大黄酸（27号峰）、大黄素（28号峰）、芦荟大黄素（23号峰）和大黄素甲醚（30号峰）。与药效相关性最大的色谱峰均存在于二氯甲烷部位，且在该部位的分布量最多。

3 讨论

炎症是机体对致炎因子损伤作用产生的一种反应，机体发生充血、肿胀、渗出、变性，局部组织缺血、缺氧伴有代谢机能改变、循环障碍等过程。其临床表现多为红肿、发热、疼痛等。正常生理状态下，炎症反应可防止机体进一步损伤并清除已受损组织；病理状态下，炎症可导致组织破坏甚至器官功能障碍[9-10]。脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁的组成部分，可刺激巨噬细胞造成炎症反应。NO既是炎症反应与免疫调节的效应因子，也是关键的调节因子，炎症发展过程中起到非常重要作用，被广泛应用于药物的抗炎作用筛选中[11-12]。

目前应用于中药谱效相关性分析的数据处理方法主要包括相关分析法、典型相关分析法、聚类分析法、主成分分析法、灰色关联度分析法、回归分析法等。各数据处理方法在具有其自身优势的同时均存在一定的缺陷[13]。相关分析法和灰色关联度分析法不能解释各色谱峰对药效的协同作用，典型相关分析法和主成分分析法需要与其他方法联用进行数学模型的建立，聚类分析无法体现各色谱峰与药效指标的相关性大小和方向。偏最小二乘法集合了多元线性回归、主成分分析和典型相关分析的优点，建立数学模型的同时排除了自变量多重共线性的干扰，最大限度地利用数据信息，可较为准确地解释各色谱峰与药效指标的相关性大小和方向，同时能够体现各色谱峰对药效指标的协同作用，具有较强的稳定性和可操作性[14]。本研究采用PLSR将唐古特大黄甲醇提取物及不同极性部位萃取物HPLC指纹特征峰与其体外抗炎活性进行谱效相关性分析，结合偏回归系数和VIP值，考察唐古特大黄30个特征峰与抗炎活性的相关性。结果表明，1（没食子酸）、11（番泻苷B）、27（大黄酸）、12、28（大黄素）、10、14（番泻苷A）、23（芦荟大黄素）、22、30（大黄素甲醚）号色谱峰对抗炎活性的影响显著，其中1（没食子酸）、11（番泻苷B）、12、10、14（番泻苷A）、22号峰与抗炎活性呈负相关。综合分析，唐古特大黄发挥抗炎活性的主要成分可能为大黄酸（27号峰）、大黄素（28号峰）、芦荟大黄素（23号峰）和大黄素甲醚（30号峰）。与药效相关性最大的色谱峰均存在于二氯甲烷部位，且在该部位的分布量最多。

本研究通过唐古特大黄甲醇提取物及不同极性部位萃取物与抗炎药效的谱效相关性研究，初步明确唐古特大黄发挥抗炎药效的活性部位主要为二氯甲烷部位。由于中药具有多成分、多靶点的作用特点，以具有活性的特征成分作为质量控制指标进行中药材质量控制尤为重要。目前以化学标志物为主的质量控制指标单一，与药效关联性不强，无法全面反映药材质量与活性成分、活性成分与药效之间的关系。课题组后续将进行不同批次唐古特大黄抗炎活性部位的谱效关系及抗炎药效组分配比研究，在控制唐古特大黄总蒽醌含量的基础上引入质量标志物配比控制，进一步完善唐古特大黄的质量标准研究，也为中药材的质量控制研究提供新思路。