刘浩,杨洪柳,柳志诚,王文琪,梁敬臣,刘永刚*
1.北京中医药大学,北京 100029
2.北京三和丽生物科技有限公司,北京 100068
白癜风是一种由黑素细胞数量减少或功能丧失导致的获得性色素脱失性皮肤病[1-2],影响全球0.1%~2.0%的人口[3]。临床表现为面部、颈部、手部等部位出现白色斑块[4],导致患者产生容貌焦虑,严重影响患者的心理健康以及生活质量[5]。目前,白癜风未有明确的发病机制,可能与神经、自身免疫、黑色素细胞失常等因素有关[6-8]。中医学认为,白癜风是由风邪相搏于皮肤,导致气血失和所引起[9-10]。
黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi 的干燥根[11]。研究表明,黄芩中主要含有黄芩苷、黄芩素等黄酮类化合物,具有抗氧化活性、抗病原微生物、调节机体免疫力、激活酪氨酸酶活性等多种药理作用,对于白癜风的治疗也有较好的疗效[12-16]。但相关文献未系统分析其物质基础以及作用机制[17]。故此,本研究应用网络药理学的相关方法,系统分析黄芩治疗白癜风的主要活性成分、核心靶点以及通路,以期为黄芩治疗白癜风的临床应用提供参考。
使用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php/),以化合物的口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18 为筛选条件[7],检索得到黄芩中的活性成分及其作用靶点,使用Uniprot 数据库(http://www.Uniprot.org/)对作用靶点进行基因名转化。通过SwissTargetPrediction 数据库(http://www.swisstarget prediction.ch/)检索得到各个活性成分的作用靶点进行补充。合并2 个数据库检索得到的作用靶点,删除重复值,即为黄芩中活性成分的作用靶点。
通过OMIM 数据库(https://www.omim.org)和GeneCards 数据库(https://www.genecards.org/)检索白癜风的相关靶点,以关键词“vitiligo”进行检索,获得2 组白癜风的潜在作用靶点。合并检索结果后删除重复值,即白癜风相关靶点。
将黄芩中活性成分的靶点和白癜风的靶点导入微生信数据分析平台(http://www.bioinformatics.com.cn)制作Venn 图,得到黄芩-白癜风的交集靶点。
将黄芩中的活性成分及其作用靶点与白癜风相关靶点的交集导入Cytoscape 3.9.1 软件,构建得到“黄芩-活性成分-白癜风靶点”网络。利用Cytoscape 3.9.1 软件中的Cyto NCA 插件对网络中各个节点的程度中心性(DC)、中介中心性(BC)、接近中心性(CC)和特征向量中心性(EC)4 个参数进行分析,根据程度中心性的数值大小,即度值(degree),筛选得到黄芩治疗白癜风的主要活性成分。
将1.3 项方法下获得的交集靶点导入String 数据库(https://string-db.org/),设置物种限定为“Homo sapien”,选择高置信度0.700 为指标,隐藏网络断开连接的节点进行分析,所得结果导入Cytoscape 3.9.1 软件获得PPI 网络可视化图,利用Cyto NCA插件对PPI 网络中各个节点的DC、BC、CC 和EC 4 个参数进行分析,根据degree 的数值大小筛选得到黄芩治疗白癜风的核心靶点。
将黄芩-白癜风的交集靶点导入Metascape 数据库(http://metascape.org),设置物种限定为“Homo sapiens”,进行基因本体论(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。使用微生信数据分析平台(http://www.bioinformatics.com.cn)制作GO 功能富集分析柱形图和KEGG 通路富集分析气泡图。
使用PubChem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),选取黄芩中degree 值排名前7 位的活性成分的2D 结构,为小分子配体。使用PDB 数据库(https://www.rcsb.org/),设置筛选条件为“Homo sapiens”和“X-RAY DIFFRACTION”,选取degree 值排名前8 位的核心靶点蛋白的3D 结构,为蛋白受体。通过PyMol 3.7.3 软件对蛋白受体进行去除水分子、添加氢原子等操作,使用AutoDockTools 1.5.7 将小分子配体和蛋白受体进行分子对接,通过PyMol 软件进行可视化处理。
通过TCMSP 数据库筛选得到符合条件的化学成分36 种,为黄芩中的活性成分(表1)。由表1 可知,新黄芩素的OB 为104.34%,与文献报道相符[18-19]。其中,5,8,2′-三羟基-7-甲氧基黄酮、2,6,2′,4′-四羟基-6′-甲氧基查耳酮、二氢木蝴蝶素A 和超烯4 种化学成分没有对应的作用靶点,使用Uniprot 数据库得到剩余32 种化学成分作用靶点的基因名。基于SwissTarget Prediction 数据库检索获取36 种活性成分的作用靶点,合并2 个数据库获取到的作用靶点,删除重复靶点,共得到黄芩中活性成分的作用靶点3 868 个。
表1 黄芩活性成分Table 1 Active components of Scutellariae Radix
通过GeneCards 数据库检索得到白癜风的相关靶点1 341 个,通过OMIM 数据库检索得到白癜风的相关靶点10 个,合并检索结果后删除2 个重复靶点,得到1 349 个相关靶点。将白癜风相关靶点与黄芩中活性成分的作用靶点导入微生信数据分析平台,制作Venn 图(图1),得到黄芩-白癜风的交集靶点113 个。
图1 黄芩-白癜风Venn 图Fig.1 Venn diagram of Scutellariae Radix-vitiligo
将黄芩中36 个活性成分及113 个交集靶点导入Cytoscape 3.9.1 软件,构建得到“黄芩-活性成分-白癜风靶点”网络(图2),其中菱形代表黄芩,椭圆形代表黄芩活性成分,长方形代表黄芩活性成分靶点,共得到148 个节点,746 条边(节点表示药物、活性成分和作用靶点,边表示三者之间的相互作用)。根据度值筛选得到前7 位的活性成分为黄芩素、汉黄芩素、刺槐素、木蝴蝶素a、表小檗碱、去甲汉黄芩素、5,7,4′-三羟基-8-甲氧基黄酮,度值越大说明该成分在治疗疾病的过程中越重要[20],表明以上7 个活性成分可能为黄芩治疗白癜风的主要活性成分,网络拓扑学分析结果见表2。
图2 黄芩-活性成分-白癜风靶点网络图Fig.2 Scutellariae Radix-active ingredient-vitiligo target network diagram
表2 黄芩治疗白癜风主要活性成分Table 2 Main active components of Scutellariae Radix in treatment of vitiligo
将黄芩-白癜风的113 个交集靶点输入String数据库,构建PPI 网络。得到的PPI 网络有113 个节点,369 条边,平均节点数为6.53,平均局部聚类系数为0.481。将所得数据导入Cytoscape 3.9.1 软件,得到PPI 网络可视化图(图3)。由图3 可知,靶点的度值越大,颜色越深,表明其可能是黄芩治疗白癜风的核心靶点。根据度值筛选得到前8 位的靶点为T 肿瘤蛋白P53(TP53)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、白细胞介素-6(IL-6)、胱天蛋白酶3(CASP3)、雌激素受体1(ESR1),表明以上8个靶点可能为黄芩治疗白癜风的核心靶点,见表3。
图3 黄芩-白癜风交集靶点PPI 网络Fig.3 PPI network of Scutellariae Radix-vitiligo intersection
表3 黄芩治疗白癜风的核心靶点Table 3 Core target of Scutellariae Radix in treatment of vitiligo
GO 功能富集分析由生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)3 部分组成。其中,BP 共1 475 条,主要包括细胞对有机氮化合物的反应(cellular response to organonitrogen compound)、对肽的响应(response to peptide)、细胞对肽的反应(cellular response to peptide)、对肽激素的响应(response to peptide hormone)、细胞对肽类激素刺激的反应(cellular response to peptide hormone stimulus)等;CC 共62 条,主要包括转录调控复合体(transcription regulator complex)、RNA 聚合酶Ⅱ转录调节复合物(RNA polymerase II transcription regulator complex)、分泌颗粒管腔(secretory granule lumen)、胞质囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen)、血小板α 颗粒管腔(platelet alpha granule lumen)等;MF 共127 条,主要包括蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、蛋白质丝氨酸激酶活性(protein serine kinase activity)、DNA 结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)等。将排名前10 位的GO 功能富集分析结果输入微生信数据分析平台,制作得到GO 功能富集分析柱形图(图4)。
图4 GO 功能富集分析柱形图Fig.4 GO functional enrichment analysis histogram
KEGG 通路富集分析结果显示,黄芩治疗白癜风的通路共192 条,去除重复项,共获得178 条通路。将排名前20 位的KEGG 通路富集分析结果输入微生信数据分析平台,制作得到KEGG 通路富集分析气泡图(图5),纵轴表示通路名称,横轴表示富集程度,气泡圆圈越大,表明富集的差异基因数量越多;颜色越浅,表明P值越小,富集越显著[21]。由图5 可知,黄芩治疗白癜风的靶点主要涉及的信号通路有糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、胰腺癌(pancreatic cancer)、内分泌抵抗(endocrine resistance)、神经营养素信号通路(neurotrophin signaling pathway)、细胞凋亡(apoptosis)、乙型肝炎(hepatitis B)、细胞衰老(cellular senescence)、丙型肝炎(hepatitis C)等。
图5 KEGG 通路富集分析气泡图Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis bubble diagram
黄芩中度值排名位于前7 位的活性成分为黄芩素、汉黄芩素、刺槐素、木蝴蝶素a、表小檗碱、去甲汉黄芩素、5,7,4′-三羟基-8-甲氧基黄酮,使用软件AutoDockTools 1.5.7 将其分别与度值排名前8 位的靶点TP53、AKT1、STAT3、TNF、MAPK1、IL6、CASP3、ESR1 进行分子对接。分子对接的结合能越小,表明小分子配体和蛋白受体之间结合越稳定,经查阅文献[22-23]可知,小分子配体和蛋白受体的结合能小于0 时,表明小分子配体和蛋白受体可以自发进行结合;小分子配体和蛋白受体的结合能小于-16.8 kJ/mol 时,表明小分子配体和蛋白受体之间具有一定的结合活性;小分子配体和蛋白受体的结合能小于-21.0 kJ/mol 时,表明小分子配体和蛋白受体之间的结合活性良好;小分子配体和蛋白受体的结合能小于-29.4 kJ/mol 时,表明小分子配体和蛋白受体之间结合活性强烈(表4)。由表4 可知,黄芩素、汉黄芩素、刺槐素、木蝴蝶素a、表小檗碱、去甲汉黄芩素、5,7,4′-三羟基-8-甲氧基黄酮7 个主要活性成分与核心靶点TP53、AKT1、STAT3、TNF、IL6、CASP3、MAPK1、ESR1 显示出较好的结合,其结合能较低表示出其具有一定的结合力。选取结合能最低的8 组,使用PyMol 软件进行处理,得到可视化网络图(图6)。
图6 部分核心靶点与黄芩主要活性成分的分子对接Fig.6 Molecular docking of some core targets with the main active components of Scutellariae Radix
表4 黄芩主要活性成分和核心靶点蛋白的分子对接结果Table 4 Molecular docking results of main active components and core target proteins of Scutellariae Radix
中医学认为,白癜风属于“白驳风”“斑驳”等范畴,对于白癜风的认识,最早可追溯到隋朝的《诸病源候论·白癜候》,其中记载道:“白癜者,面及颈项身体皮肤肉色变白,与肉色不同,也不痒痛,谓之白癜。此亦是风邪搏于皮肤,血气不和所生也”。明确指出白癜风的临床症状为面部、颈部等暴露在外处的皮肤肤色变白,形成白斑。同时指出,风邪相搏、气血失和为此病的病因病机[9]。时至清朝,王清任在其著作《医林改错》中指出淤血阻滞为白癜风的病机。因此,中医对于白癜风的治疗以“祛风活血,理气通络”为核心治法[24],主要采用经方、单味中药以及针灸等治疗方法和手段[9-10]。其中,单味中药治疗具有疗效显著、不良反应少等优势,相关研究越来越多。Zabolinejad 等[25]研究发现,补骨脂联合窄波UVB 治疗白癜风疗效优于单用窄波UVB,且并发症少;Yuan 等[26]研究发现,芍药中的活性成分芍药苷可以通过JNK/Nrf2/HO-1 通路,抵抗H2O2诱导的黑素细胞氧化应激,以此发挥治疗白癜风的作用;Ma 等[27]研究发现,黄芩中的活性成分黄芩素可激活Nrf2 信号通路,减轻H2O2诱导的线粒体功能障碍和细胞损伤,从而保护白癜风黑素细胞免受氧化应激。
中药具有多成分、多靶点、多通路的特点,关于黄芩中单个化学成分治疗白癜风的作用机制,已存在较多研究[14-15,27],但未系统分析黄芩治疗白癜风的主要活性成分、核心靶点以及通路。本研究通过网络药理学的相关方法,共获得黄芩中的活性成分36 个以及3 868 个作用靶点,白癜风的相关靶点共1 349 个。使用Cytoscape 3.9.1 软件构建“黄芩-活性成分-白癜风靶点”网络,经过网络拓扑学参数分析,根据度值大小,筛选得到黄芩素、汉黄芩素、刺槐素、木蝴蝶素a、表小檗碱、去甲汉黄芩素、5,7,4′-三羟基-8-甲氧基黄酮 7 个化合物作为黄芩治疗白癜风的主要活性成分,表明这些活性成分对于白癜风的治疗具有关键作用。
PPI 网络分析结果显示,黄芩治疗白癜风的核心靶点包括TP53、AKT1、STAT3、TNF、MAPK1、IL-6、CASP3、ESR1。TP53 作为一种转录调节因子,主要参与调节细胞凋亡、调控细胞周期等过程[28-29];AKT1 属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC 家族,主要调节细胞的存活和凋亡[30];STAT3[31]、TNF[32]、MAPK1[7]在控制炎症方面具有关键作用;IL-6 在免疫反应中具有核心作用[33];CASP3 主要参与细胞凋亡过程[7,34];ESR1 是编码雌激素受体α 的基因,属于内分泌激素[7,35]。经过上述分析,8 个核心靶点主要与细胞凋亡、炎症、免疫反应和内分泌等密切相关。
GO 功能富集分析结果显示,TP53、AKT1、STAT3、TNF、MAPK1、IL6、CASP3、ESR1 8 个核心靶点主要是通过影响蛋白激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白质丝氨酸激酶活性、DNA 结合转录因子结合、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合等分子功能对白癜风进行治疗。KEGG 通路富集分析结果显示,黄芩治疗白癜风的靶点主要涉及的信号通路包括糖尿病、癌症、内分泌、神经、细胞衰老和凋亡以及炎症等,这与现代医学认为白癜风的发病机制[36-37]为神经精神因素学说、黑素细胞失常学说和自身免疫功能学说等观点基本一致。
分子对接结果显示,黄芩中的主要活性成分黄芩素、汉黄芩素、刺槐素、木蝴蝶素a、表小檗碱、去甲汉黄芩素、5,7,4′-三羟基-8-甲氧基黄酮与核心靶点TP53、AKT1、STAT3、TNF、MAPK1、IL-6、CASP3、ESR1 具有良好的结合活性。因此,黄芩中的黄芩素、汉黄芩素、刺槐素等主要活性成分可能调节TP53、AKT1、STAT3、TNF、MAPK1、IL-6、CASP3、ESR1 等靶点,通过抑制黑素细胞凋亡、抵抗炎症、调节免疫等过程,发挥治疗白癜风的作用。
综上所述,本研究通过网络药理学方法阐述了黄芩治疗白癜风的作用机制,充分体现了黄芩多成分、多靶点、多通路的作用特点,以期为深入研究黄芩治疗白癜风的作用机制提供理论参考,但本研究未进行实验验证,后续期望通过进一步的体内外实验对黄芩治疗白癜风的作用机制进行验证。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突